Gensko kartiranje je možno z uporabo. Kartiranje genoma (genetske, citološke in fizikalne karte kromosomov). Kartiranje človeškega genoma

Genetske in fizične karte Glede na splošno sprejeto klasifikacijo so metode kartiranja genoma razdeljene v dve kategoriji: p Genetsko kartiranje p Fizično kartiranje 2

Izdelava genetskih zemljevidov p p Markerji so položaji katerih koli značilnih lastnosti. Geni, ki opredeljujejo zlahka razločljive fenotipe, se že desetletja uporabljajo kot markerji. Za kompleksnejše zemljevide so bile njegove biokemične značilnosti uporabljene kot fenotipske značilnosti organizma. Zemljevid, ki temelji na genih, morda ni zelo podroben. Prav tako le del celotnega števila genov obstaja v priročno razločljivih alelnih oblikah. 3

Markerji DNK Markerji DNK so preslikane značilnosti, ki niso geni. Vsak uporaben marker DNK mora imeti dva alela, tako kot markerski gen. To zahtevo izpolnjujejo tri vrste značilnosti zaporedja DNA: - polimorfizmi dolžine restrikcijskih fragmentov (RFLP); - enostavni polimorfizmi dolžine zaporedja (SSLP); - Polimorfizmi enega nukleotida (SNP). 4

1 DNK marker. Polimorfizmi restrikcijskih dolžin RFLP so prvi tip markerja DNA, ki je bil v celoti raziskan. Restrikcijski encimi režejo DNK na specifičnih prepoznavnih mestih. Ta specifičnost pomeni, da mora obdelava molekule DNA z restrikcijskim encimom proizvesti enak niz fragmentov. To se ne zgodi vedno pri molekulah genomske DNK, saj so nekatera restrikcijska mesta polimorfna in obstajajo v obliki dveh alelov: eden kaže pravilno zaporedje za restrikcijsko mesto in ga zato encim pri obdelavi DNK prereže, drugi alel pa nosi modifikacijo zaporedja, tako da restrikcijsko mesto ni več identificirano. Posledično dva sosednja restrikcijska fragmenta 5 ostaneta povezana skupaj, kar

RFLP Imaging 2. PCR se uporablja veliko pogosteje. Primerji PCR so zasnovani tako, da se žarijo na obeh straneh polimorfne regije, RFLP pa se tipizira z obdelavo razmnoženega fragmenta z restrikcijskim encimom in nato spuščanjem vzorca na agarozni gel. 8

2 DNK marker. Polimorfizmi dolžine enostavnega zaporedja SSLP - nizi ponovljenih zaporedij, ki kažejo spremembe v dolžini; različni aleli vsebujejo različno število ponavljajočih se enot. Obstajata dve vrsti SSLP: minisateliti in mikrosateliti. Dve različici nekega STR (mikrosatelit) s ponavljajočo se sekvenco GA 9

Vrste minisatelitov SSLP (spremenljivo število tandemskih ponovitev ali VNTR). Enota za ponavljanje je lahko dolga do 25 bp. 2. Mikrosateliti (preprosta tandemska ponavljanja ali STR). Ponovi element - ​​13 bp. ali manj. 1. 10

Vrste označevalcev DNK SSLP, ki temeljijo na mikrosatelitih, so bolj priljubljene od tistih, ki temeljijo na minisatelitih, iz dveh razlogov: - Minisateliti so neenakomerno razporejeni po celotnem genomu, pogosteje jih najdemo v telomernih regijah na koncih kromosomov, mikrosateliti so bolj enakomerno razporejeni po celotnem genomu. -natančna tipizacija dolžinskega polimorfizma s PCR je možna pri dolžinah zaporedja največ 300 bp. , večina minisatelitnih alelov pa je 11

3 DNK marker. Polimorfizmi enega nukleotida SNP so genomski položaji, v katerih imajo nekateri posamezniki en nukleotid, kot je G, drugi pa drugačen nukleotid - str. 12

Večina SNP-jev ima 2 alela, ker se SNP-ji pojavijo, ko pride do točkovnih mutacij v genomu, ki pretvorijo en nukleotid v drugega. Če se taka mutacija pojavi v reproduktivnih celicah, lahko eden ali več njegovih potomcev podeduje mutacijo in sčasoma se SNP utrdi v populaciji. 13

Metode tipizacije SNP Metode temeljijo na analizi s hibridizacijo oligonukleotidov. -Tehnologija čipa DNA -Metode hibridizacije raztopine -Oligonukleotidna ligacijska analiza (OLA) -Toplotno stabilen sistem razmnoževanja mutacij ali test ARMS. 14

Metode tipizacije SNP Tehnologija DNK čipa DNK, namenjen testiranju, označen s fluorescenčnim markerjem, se pipetira na površino 2 cm 2 steklene plošče, ki vsebuje veliko različnih oligonukleotidov. Hibridizacijo zaznamo z analizo čipa s fluorescenčnim mikroskopom. Položaji, na katerih se oddaja fluorescentni signal, kažejo, kateri oligonukleotidi 1. 15

Metode tipizacije SNP 2. Metoda hibridizacije raztopine Uporablja se par oznak, ki vključuje fluorescentno barvilo in snov, ki ugasne fluorescentni signal, ko se približa barvilu, ki ga oddaja. Barvilo je pritrjeno na en konec oligonukleotida, sredstvo za gašenje pa je pritrjeno na drugi konec. Če pride do hibridizacije med oligonukleotidom in testno DNA, je to združevanje baz moteno, dušilec se loči od barvila in proizvede fluorescentni signal. 16

Metode tipizacije SNP 3. Analiza nukleotidne ligacije (OLA) Uporablja dva oligonukleotida, ki se žarita drug ob drugem, pri čemer 3'-konec enega od njiju natančno pade v SNP. Ta oligonukleotid tvori popolnoma bazno parno strukturo, če je ena različica SNP prisotna v vzorčni DNK, in ko se to zgodi, je ta oligonukleotid lahko 17

Metode tipizacije SNP 4. Toplotno stabilen sistem razmnoževanja mutacij (test ARMS) Kontrolni oligonukleotid je eden od para začetnikov PCR. Če se kontrolni primer prižge na SNP, ga lahko nadaljuje polimeraza Taq in lahko pride do PCR, če pa se ne prižge, ker je prisotna alternativna različica SNP, ne bodo proizvedeni produkti PCR.

Povezanost genetskih lastnosti Genetsko kartiranje temelji na zakonih dednosti, ki jih je leta 1865 opisal Gregor Mendel. Poleg prvih dveh Mendelovih zakonov obstajata še dva primera nenavadne povezave: - nepopolna prevlada (heterozigotna oblika kaže vmesni fenotip med dvema homozigotnima oblikama); -Kodominanca (heterozigotna oblika kaže oba homozigotna fenotipa) 19

Odločilni korak v razvoju genskega kartiranja Ko so leta 1900 ponovno odkrili Mendelove zakone, so ugotovili, da ni prišlo do popolne povezave, ki je bila pričakovana med številnimi pari genov. Pari genov so bili podedovani neodvisno ali pa so pokazali le nepopolno povezavo: včasih so bili podedovani skupaj, včasih ločeno. p Razrešitev tega protislovja je bila odločilen korak v razvoju genetskega kartiranja. str 20

Utemeljitev Thomasa Morgana Nepopolno povezovanje je razloženo z obnašanjem kromosomov med mejozo. p Proces crossing overja (ali rekombinacije) je odkril belgijski citolog Jansen leta 1909 in je pomagal Morganu razložiti nepopolno povezavo. Razmislite o učinku, ki ga ima križanje na dedovanje genov. str 21

Učinek križanja Obstajata dva možna scenarija: p Med genoma A in B ne pride do križanja. Nato imata dve gameti genotip AB, drugi dve pa genotip ab. p Do križanja pride med genoma A in B. Posledica tega je izmenjava segmentov DNA med homolognimi kromosomi. Posledično ima vsaka gameta drugačen genotip od drugih: AB, a. B, Ab in ab. Poleg gamet s starševskimi genotipi so še gamete z 22

Preslikava genetskih zemljevidov Ko je Morgan razložil nepopolno povezavo kot crossing over, je izumil način za preslikavo posameznih položajev genov na kromosomu. Predpostavimo, da je crossing over naključen dogodek, kar pomeni, da se lahko pojavi na katerem koli mestu vzdolž para kromatid, raztegnjenih ena vzdolž druge. Če je to res, potem bosta dva gena, ki se nahajata blizu drug drugega, ločena s križanjem manj pogosto kot geni, ki ležijo bolj narazen. Pogostost, s katero so geni ločeni s križanjem, bo neposredno sorazmerna z njihovo medsebojno razdaljo. Zato je frekvenca rekombinacije merilo razdalje 23

Analiza povezav genetskih lastnosti v organizmih različnih vrst. Vključuje tri situacije: p Analiza povezav genetskih lastnosti pri vrstah, kot sta vinska mušica in miš, s katerimi je mogoče izvesti poskuse križanja; p Analiza povezanosti genetskih lastnosti pri ljudeh, pri katerih ni mogoče izvajati poskusov, lahko pa preučujemo rodovnike; p Analiza povezav genetskih lastnosti pri bakterijah, ki niso 24

Metoda povezanosti genetskih lastnosti z možnostjo križanja temelji na analizi potomcev iz poskusnih križanj z znanimi genotipi staršev. Običajno se uporablja testno križanje. Ta metoda je uporabna za vse evkarionte, vendar zaradi etičnih razlogov ni uporabna za ljudi. 25

Izdelava genetskega zemljevida na podlagi analize osebnega rodovnika Pogosto lahko znanstveniki zaradi skladnosti z znanstveno in medicinsko etiko operirajo le s skromnimi podatki, saj zakonske zveze le redko zagotavljajo priročna analitična križanja, genotipi številnih družinskih članov pa so morda neznani. zaradi smrti ali nepripravljenosti na sodelovanje. Običajno je za rešitev potrebnega genetskega problema dovolj, da dodatno poznamo genotip vsaj enega sorodnika, vendar je to iz različnih razlogov nemogoče. 26

Sestavljanje genetskih zemljevidov bakterij Glavna težava je v tem, da so bakterije haploidne in niso podvržene mejozi. Zato se uporabljajo trije načini, ki lahko povzročijo crossing over: p Med procesom konjugacije se prenese epizom (odsek kromosomske DNA do 1 milijon bp) p Transdukcija (prenos fragmenta DNA do 50 tisoč bp). preko bakteriofaga) p Transformacija (prejemna celica 27

Izdelava fizičnih zemljevidov Zemljevid, pridobljen izključno z genetskimi metodami, ne bo popolnoma točen. To je posledica naslednjih razlogov: 1. Ločljivost genetske karte je odvisna od števila rekrutiranih križancev. Za mikroorganizme to ni večji problem, saj jih je mogoče dobiti v poljubnih količinah. Težava pri ljudeh in drugih evkariontih je, da je nemogoče pridobiti veliko število potomcev, saj jih je mogoče preučiti le 28.

Izdelava fizičnih zemljevidov 2. Genetski zemljevidi imajo omejeno natančnost. Slika prikazuje primerjavo fizikalne in genetske karte kvasovke Saccharomyces cerevisiae. Primerjava pokaže, da je vrstni red prvih dveh markerjev na genetski karti napačen, razlike pa so tudi v relativnih 29

Sestavljanje restrikcijskih zemljevidov Najpreprostejši način za sestavljanje restrikcijskih zemljevidov je primerjava velikosti fragmentov, ki jih dobimo s prebavo molekule DNK z dvema različnima restrikcijskima encimoma. Izbira edine pravilne karte omogoča dodatno obdelavo originalne DNK z enim encimom, ki preprečuje, da bi se prebava nadaljevala do konca. To se imenuje delna omejitev. Merilo omejitvene karte je omejeno z dolžino omejitvenih pasov. Restrikcijsko preslikavo je bolj primerno za majhne molekule. 31

Zbiranje restrikcijskih zemljevidov Ali je mogoče uporabiti restrikcijsko analizo za preslikavo genomov, večjih od 50 tisoč bp? ? Da, omejitve restrikcijskega kartiranja je mogoče sprostiti z izbiro encimov, ki imajo redka rezalna mesta v ciljni molekuli DNA (»restrikcijski encimi z nizkim rezom«) 32

Metoda OFAGE Gel elektroforeza z ortogonalno izmeničnim poljem. Tako vsaka sprememba v polju prisili molekule, da se prerazporedijo, kratke molekule se prerazporedijo in električno polje izmenično migrira skozi gel med obema paroma hitreje kot dolga. Zaradi elektrod, od katerih vsaka omogoča to tehniko postavimo pod kotom 45° na daljše fragmente, vzdolžno linijo gela. kot pri običajni elektroforezi. Med tovrstne metode spadata tudi CHEF - gelska elektroforeza z enotnimi električnimi polji in 33 FIGE - gelska elektroforeza z obračanjem polja.

Neposredno opazovanje restrikcijskih mest v molekulah DNA. Za kartiranje restrikcijskih mest se lahko uporabljajo druge metode razen elektroforeze. p Metoda optičnega preslikave: položaje restrikcijskih mest določimo z neposrednim opazovanjem izrezanih molekul DNA pod mikroskopom. Za fiksiranje DNK na stekelcu se uporablja vlečenje z gelom in česanje molekul. p Za odstranjevanje gela kromosomsko DNK suspendiramo v staljeni agarozi in postavimo na mikroskopsko stekelce. Ko se gel ohladi in strdi, se molekule DNK raztegnejo. p Za česanje vlakna DNK pripravimo tako, da pokrovno stekelce, prevlečeno s silikonom, pomočimo v raztopino DNK in ga tam pustimo 5 minut. Nato kozarec odstranite iz raztopine. Sila, ki je potrebna za vlečenje DNK skozi površinski meniskus, povzroči, da se vsak od njih potegne v črto. Ko se DNK posuši

Fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) Pri tej tehniki je marker zaporedje DNA, ki se prikaže s hibridizacijo s fluorescenčno sondo. Nemoten kromosom pregledamo tako, da ga sondiramo z označeno molekulo DNA. Da bi metoda delovala, je DNK v kromosomu denaturirana (posušena na predmetnem stekelcu in obdelana 36

FISH v akciji 1. 2. Sprva je bila metoda uporabljena z metafaznimi kromosomi, vendar njihovo močno zbijanje ni omogočalo zemljevidov visoke ločljivosti. Leta 1995 je bilo razvitih več metod FISH z višjo ločljivostjo. To je bilo doseženo s spremembo narave proučevanega kromosomskega aparata. Če so metafazni kromosomi preveč stisnjeni za obsežno preslikavo, potem bi morali uporabiti bolj podolgovate kromosome. To lahko dosežete na dva načina. Mehansko podaljšane kromosome lahko dobimo s spremembo metode priprave, ki se uporablja za izolacijo kromosomov iz metafaznih jeder. Nemetafazni kromosomi se uporabljajo, ker so v vseh fazah celičnega cikla, razen v metafazi, kromosomi v svojem naravnem razgrnjenem stanju. Interfazni kromosomi

Preslikava z oznako zaporedja (STS) je trenutno najmočnejša metoda fizičnega preslikave. Sequence tagged region ali STS je kratko zaporedje DNA, 100–500 bp. po dolžini, ki jo je zlahka prepoznati in se pojavi samo enkrat v kromosomu ali genomu, ki ga proučujemo. Za preslikavo nabora STS je potrebno imeti več prekrivajočih se fragmentov DNK iz enega samega kromosoma ali celotnega genoma. Kateri fragmenti vsebujejo kateri STS, se določi s hibridizacijsko analizo ali bolj pogosto s PCR. Vsako edinstveno zaporedje DNK se lahko uporabi kot STS. Za to je treba poznati zaporedje DNK in STS mora imeti edinstveno lokacijo na kromosomu, ki ga preučujemo.

Metode pridobivanja STS 1. 2. 3. Ekspresirane sekvence oznak - kratke sekvence pridobljene z analizo klonov DNA. Polimorfizmi dolžine preprostega zaporedja (SSLP) Naključna genomska zaporedja – pridobljena s sekvenciranjem naključnih delov klonirane genomske DNA. 39

Fragmenti DNK za preslikavo z uporabo STS Sicer reagent za preslikavo; obstajajo v obliki knjižnice klonov in radiacijskih hibridov. Radiacijski hibrid je celica glodalca, ki vsebuje fragmente kromosomov drugega organizma. Ko je bil kromosom razbit na fragmente, je večja doza sevanja povzročila večje število fragmentov. Fuzija se stimulira kemično (s polietilen glikolom) ali biološko z virusom Sendai. 40

Sklepi p p p Zemljevidi genoma so referenčna zasnova za projekte sekvenciranja, ker omogočajo preverjanje točnosti sestavljenega zaporedja DNK. Genetski zemljevidi so izdelani na podlagi rezultatov poskusov križanja in analize rodovnika, medtem ko so fizični zemljevidi izdelani z neposrednim opazovanjem molekul DNK. Na prvih genetskih zemljevidih ​​so bili označevalci geni, katerih alele je bilo mogoče zlahka razlikovati (po močno različnih fenotipih), danes pa so označevalci DNK polimorfizmi dolžine restrikcijskih fragmentov (RFLP), polimorfizmi dolžine enostavnega zaporedja (SSLP) in polimorfizmi enega nukleotida (SNP). . Vse jih je enostavno tipizirati s PCR. Analiza povezav genetskih lastnosti omogoča določitev pogostosti rekombinacije med parom markerjev. Za mnoge organizme se analiza povezav genetskih lastnosti izsledi z načrtovanimi 41 poskusi križanja. Vodenje jih z ljudmi

Sklepi p p p Genetsko kartiranje človeškega genoma temelji na informacijah, pridobljenih z analizo rodovnika. Nizka ločljivost genetskih zemljevidov je izboljšana s fizičnim kartiranjem. V molekuli DNA so položaji restrikcijskih mest določeni z restrikcijskim preslikavanjem. Bolj produktivna je fluorescenčna hibridizacija, pri kateri se zdravilo sondira z markerjem, označenim s fluorescentno oznako. Položaj hibridizacije določimo z mikroskopom. Najbolj podrobne fizične karte so pridobljene s preslikavo vsebine zaporednih oznak (STS). Položaj označbe na zemljevidu določajo fragmenti iz zbirke kopij označbe. 42

Gensko kartiranje. Metode genskega kartiranja. Sevostyanova Natalia Vladimirovna doktorica medicinskih znanosti, profesorica oddelka za biologijo in genetiko

Diapozitiv 2

Načrt predavanja Gensko kartiranje. Kromosomske karte. Citološke karte. Metode genskega kartiranja. Testiranje mutacij za alelizem. Kromosomske mutacije.

Diapozitiv 3

Genetsko kartiranje je določitev položaja mapiranega gena glede na druge gene na določenem kromosomu. Več ko je znanih genov pri določeni vrsti, bolj natančni so rezultati.

Diapozitiv 4

Genetska karta kromosoma je diagram relativne razporeditve genov, ki se nahajajo v isti vezni skupini. Kot je znano, ima D. melanogaster v svojem diploidnem kompletu štiri pare kromosomov.

Diapozitiv 5

Takšen zemljevid je mogoče sestaviti samo za objekte, v katerih je bilo raziskano veliko mutantnih genov. Na primer, pri Drosophili je bilo identificiranih več kot 500 genov, ki so razvrščeni v 4 skupine povezav. Skupina I - spolni kromosomi (XX - ženske, XY - moški), II, III, IV - avtosomi.

Diapozitiv 6

Koruza ima več kot 400 genov, razdeljenih v 10 veznih skupin

Diapozitiv 7

Za sestavljanje genetskih zemljevidov kromosomov je potrebno identificirati številne mutirane gene in opraviti številne križance.

Diapozitiv 8

Genetske kromosomske karte se sestavijo za vsak par homolognih kromosomov. Skupine sklopk so oštevilčene zaporedno, ko so odkrite. Navedena so tudi polna ali skrajšana imena mutantnih genov in njihove razdalje pri morganidah. Označuje lokacijo centromere.

Diapozitiv 9

Pri manj raziskanih objektih je število odkritih veznih skupin manjše od haploidnega števila kromosomov. Bakterije, ki so haploidni organizmi, imajo en, največkrat neprekinjen, krožni kromosom in vsi geni tvorijo eno vezno skupino. Genetska karta kromosoma E. coli.

10

Diapozitiv 10

Metode genskega kartiranja Fizična determinacija z uporabo restrikcijskih zemljevidov elektronske mikroskopije variant elektroforeze medgenskih razdalj - v nukleotidih Genetska determinacija rekombinacijskih frekvenc med geni, zlasti v družinski analizi itd. Citogenetske in situ hibridizacije, proizvodnja monokromosomskih celičnih hibridov, delecija metoda itd.

11

Diapozitiv 11

Testiranje alelizma mutacije Funkcionalni test alelizma, ki vam omogoča, da ugotovite, ali mutirani aleli pripadajo istemu lokusu ali različnim. Dobijo se hibridi (heterokarioni), pri katerih se proučevani mutaciji nahajata na različnih homolognih kromosomih - Trans položaj.

12

Diapozitiv 12

Če obe mutaciji delujeta na različne neodvisne funkcije (vplivata na dva različna gena), potem ima tak hibrid divji fenotip, saj nastane diheterozigot, v katerem normalni aleli prevladujejo nad mutantnimi. Če preučevane mutacije vplivajo na isto funkcijo (poškodujejo isti gen), potem mora imeti hibrid mutant fenotip.

13

Diapozitiv 13

Cis test - dobimo hibride, pri katerih je obe testirani mutaciji vnesel eden od staršev, medtem ko kromosomi drugih vsebujejo normalne alele. Hibridi s cis mutacijami bi morali imeti fenotip divjega tipa, ne glede na to, ali so testirane mutacije v istih ali različnih genih. To je razlog, zakaj se cis test redko uporablja.

14

Diapozitiv 14

Mejotski in mitotični crossing over se uporabljata za izdelavo genetskega zemljevida evkariontskih kromosomov. Primerjava genetskih zemljevidov kromosomov, izdelanih z različnimi metodami pri isti vrsti, razkrije enak vrstni red razporeditve genov, čeprav se lahko razdalja med določenimi geni na mejotskih in mitotičnih genetskih zemljevidih ​​kromosomov razlikuje. Nekatere od teh napak je mogoče opaziti s citogenetskimi metodami

15

Diapozitiv 15

Mejotski crossing over je kompleksen proces, med katerim lahko pride do napak. Navzkrižna izmenjava se izvaja po tipu prekinitev-ponovna združitev. Citološka ilustracija tega mehanizma je mejotsko prehajanje med različno obarvanimi sestrskimi kromatidami. Včasih ponovna združitev kromatid ne poteka pravilno, kar lahko privede do tvorbe dicentričnih kromosomov in acentričnih fragmentov.

16

Diapozitiv 16

Običajno so genetske karte kromosomov pri evkariontih linearne. Pri izdelavi genetskih zemljevidov kromosomov v heterozigotih za translokacijo dobimo genetski zemljevid kromosomov v obliki križa. To kaže, da oblika zemljevidov odraža naravo konjugacije kromosomov.

17

Diapozitiv 17

Navzkrižne izmenjave, ki vključujejo napake pri ponovni združitvi kromatid, se imenujejo U izmenjave. Izmenjave U najdemo v številnih rastlinskih in živalskih vrstah. Najbolj podrobno so jih raziskali pri rži (Jones, Brumpton, 1971). Pogostost U-konfiguracije v rži lahko doseže 30-40% na celico ali 4-5% na bivalent. Pogostost nesestrskih izmenjav U je bistveno višja kot pri sestrskih izmenjavah. Neustrezna ponovna združitev kromatidov je lahko eden od dejavnikov, ki vodijo do nastanka neuravnoteženih gamet.

18

Diapozitiv 18

Na podlagi študije politenskih kromosomov je sestavljen citološki zemljevid, ki omogoča primerjavo strukture sintetiziranega proteina z določeno regijo kromosoma (genom), saj se transkribirana regija določi pod mikroskopom v obliki puff. To omogoča določitev lokacije gena.

19

Diapozitiv 19

Citološka karta kromosoma je fotografija ali natančna risba kromosoma, ki prikazuje zaporedje genov. Zgrajena je na podlagi primerjave rezultatov analize križanj in kromosomskih preureditev. Na primer, če kromosom s prevladujočimi geni dosledno izgubi posamezne lokuse (če je izpostavljen mutagenom), se bodo v heterozigotu začele pojavljati recesivne lastnosti. Vrstni red, v katerem se pojavljajo lastnosti, bo pokazal zaporedje genov.

20

Diapozitiv 20

Metoda citološke karte temelji na uporabi kromosomskih preureditev. Pri obsevanju in izpostavljenosti mutagenom v kromosomih pogosto opazimo izgube (delecije) ali vstavitve (podvojitve) majhnih fragmentov, ki so po velikosti primerljivi z enim ali več lokusi. Na primer, lahko uporabite heterozigote na kromosomih, od katerih bo eden nosil skupino zaporednih dominantnih alelov, homologni pa bo nosil skupino recesivnih alelov istih genov ABCDE / abcde. Če je kromosom s prevladujočimi geni izgubil posamezne gene, na primer DE, bo heterozigot ABC/abcde pokazal recesivne lastnosti de. Na tem principu temelji metoda prekrivanja delecij, ki se uporablja pri izdelavi citoloških kart!!!

21

Diapozitiv 21

Citogenetske karte kromosomov so sestavljene na podlagi diferencialnega barvanja (temni in svetli pasovi) in preslikave genov na posameznih kromosomskih lokusih.

22

Diapozitiv 22

Citogenetske karte zagotavljajo informacije o lokaciji gena na kromosomu glede na njegove regije, identificirane z metodami diferencialnega barvanja. Zahvaljujoč temu barvanju je kromosom v vidnem polju mikroskopa videti "prečno črtast".

23

Diapozitiv 23

Lokacija obarvanih področij (trakov) je specifična za vsak kromosom.

24

Diapozitiv 24

Uporaba metode FISH omogoča izdelavo citogenetskih zemljevidov z ločljivostjo 2-5 Mb in njene modifikacije za interfazne kromosome - 0,1 Mb. Tako je mogoče določiti lokalizacijo gena, preslikanega z metodo FISH, z natančnostjo podsegmenta in pasu lokusa.

25

Diapozitiv 25

Kartiranje genov z uporabo kromosomskih mutacij Intrakromosomske mutacije so transformacija genetskega materiala znotraj enega kromosoma. Medkromosomske - preureditve, zaradi katerih dva nehomologna kromosoma izmenjata svoje odseke. Kromosomske mutacije so spremembe v strukturi kromosomov

26

Diapozitiv 26

Inverzije Inverzije - kromosomske preureditve, povezane z rotacijo posameznih odsekov kromosomov za 180 °, je leta 1926 odkril A. Sturtevant.

27

Diapozitiv 27

Paracentrična inverzija - pride do dveh prelomov kromosomov, oba na isti strani centromere. V območju med prelomnimi točkami se pojavi pericentrična inverzija - prelomne točke se nahajajo na obeh straneh centromere.

28

Diapozitiv 28

Pri posameznikih, heterozigotnih za inverzijo, se v kromosomih oblikuje zanka. Pri posameznikih, homozigotnih za inverzije, pride do crossing overja brez sprememb.

29

Diapozitiv 29

Pri heterozigotnih posameznikih s paracentrično inverzijo se crossing over »zaklene« na naslednji način: v primeru crossoverja med genoma C in D nastaneta dva produkta: acentrični kromosomi in dicentrični kromosomi, to je brez centromere oziroma z dvema centromerama. Obe kombinaciji sta smrtonosni.

30

Diapozitiv 30

Dicentrik tvori "kromosomski most" v anafazi 1 mejoze, ki je viden pod mikroskopom. Obe kombinaciji sta smrtonosni. Tako se zaradi križanja oblikujejo nesposobne gamete in ni potomcev.

31

Diapozitiv 31

Pri pericentrični inverziji dobimo v primeru križanja med genoma C in D tudi dva produkta. Podvojitev A in delecija F. Vsak od nastalih kromosomov nosi podvojitev ene neinvertirane kromosomske regije in delecijo druge. Posledično takšne gamete niso sposobne preživetja in križanja niso zaznana. Tako kot paracentrične inverzije tudi pericentrične inverzije »zaklenejo« prehod. Ker je prehod v obrnjeni regiji kromosoma "zaklenjen", se lahko v njem oblikujejo bloki mutacij, ki se razlikujejo od tistih, ki so lokalizirane v homolognem fragmentu kromosoma, ne pa tudi obrnjenega. Ta pojav imenujemo inverzijski polimorfizem populacij.

32

Diapozitiv 32

Kromosomi z več inverzijami se uporabljajo za ustvarjanje balanserjev, to je linij, ki omogočajo vzdrževanje smrtnih mutacij in mutacij plodnosti. Eden od primerov je črta C L B. Bolj zanesljivi balanserji, ki vsebujejo več inverzij, so črte Base, Binsn. Konstrukcija ravnotežnih kromosomov v bistvu predstavlja prvi primer genskega inženiringa. Drug primer uravnoteženja je linija Su (ukrivljena krila, letalnost), pri kateri je dominantna mutacija povezana z dolgo inverzijo, ki pokriva skoraj celoten drugi kromosom. V potomcih križanja heterozigotov za Cy preživijo samo muhe starševskih razredov, tj. Linija je uravnotežena, preučevani letalni f pa se nenehno vzdržuje v heterozigotnem stanju.

33

Diapozitiv 33

Uporabo izbrisov za lokalizacijo genov imenujemo kartiranje izbrisov. Delecije Delecija je izguba dela kromosoma. Delecije je leta 1917 z genetskimi metodami odkril K. Bridges. V normalnem kromosomu so geni locirani v določenem vrstnem redu: tABCDEF Pri izgubi fragmenta kromosoma sta možni dve temeljni možnosti: ABEF ali ABC, torej lahko se izgubi srednji ali končni del kromosoma.

34

Diapozitiv 34

Translokacije Kromosomske preureditve, zaradi katerih se del kromosoma prenese na drugo mesto istega kromosoma ali na drug kromosom. Skupno število genov pa se ne spremeni!!! Translokacije je odkril K. Bridges leta 1923 pri Drosophili.

35

Diapozitiv 35

Intrakromosomske translokacije nastanejo kot posledica nastanka treh prelomov in prenosa kromosomskega segmenta v drugo regijo istega kromosoma. Interkromosomske recipročne translokacije nastanejo kot posledica tvorbe dveh prelomov in izmenjave delov nehomolognih kromosomov.

36

Diapozitiv 36

Dva kromosoma zaradi vzajemne izmenjave fragmentov tvorita heterozigotno translokacijo. Če nastanejo trije prelomi in se kromosomski fragment odstrani iz enega kromosoma in vstavi v drugega, je to insercijska translokacija.

37

Diapozitiv 37

Najbolj osupljiv primer, kjer je bil gen preslikan s translokacijo, je Duchennova miopatija. Gen za Duchennovo miopatijo se nahaja na kromosomu X in se običajno kaže kot huda miopatija pri dečkih. Vendar pa je bilo ugotovljenih več primerov značilne klinične slike miopatije pri ženskah. Izkazalo se je, da so povezani s translokacijami med kromosomom X in avtosomi, pri kromosomu X pa je bil prelom vedno lokaliziran v regiji Xp21.

38

Diapozitiv 38

Kartiranje genov je včasih mogoče doseči z izkoriščanjem učinka odmerjanja genov. V primeru delecije je treba pričakovati 50-odstotno zmanjšanje genskega produkta (lahko gre predvsem za encim). Na ta način je bil gen za kislo fosfatazo eritrocitov preslikan na kromosom 2.

Preslikava je najlažji način za priklop kontigov.

Kartiranje genoma je lahko genetsko ali fizično.

Gensko preslikavo:

Vsebuje gen - fenotipski marker;

Molekularni markerji:

RFLP (polimorfizem dolžine restrikcijskih fragmentov) je metoda za proučevanje genomske DNK z rezanjem DNK z uporabo restrikcijskih endonukleaz (cepijo nukleinske kisline na sredini) in nadaljnjo analizo nastalih fragmentov (restrikcij) z gelsko elektroforezo;

SSLP (polimorfizem dolžine preprostega ponavljanja) - Obstajata 2 vrsti: minisateliti in mikrosateliti. Mikrosateliti– ponovite 2,3,4 n.p. Gre za napake v delovanju DNA polimeraze. Kadar obstaja mesto, kjer se oligonukleotid večkrat ponovi, obstaja možnost zdrsa DNA polimeraze. Z določeno stopnjo verjetnosti se lahko loči od matrike in se pridruži sosednji ponovitvi. Posledično bo imela replikacija eno ponovitev več ali eno manj;

SNP ( Polimorfizem enega nukleotida) – razlike v zaporedju DNA 1 nukleotida v genomu predstavnika iste vrste;

Odkrivanje molekularnih markerjev:

1. Hibridizacija DNK:

1.1. Sonde se bodo združile z enoverižno DNK in tako ustvarile popolne ali nepopolne komplemente.

1.2. Elektroforeza v PAA. Prenesite z nitroceluloznim papirjem. Radioaktivno označene sonde se hibridizirajo z DNA. Odkrito avtoradiografsko.

Uporablja se za odkrivanje molekularnih markerjev:

1. Ponavljajoči se lokusi;

2. Polimorfizem restrikcijskih fragmentov (RFLP, RFLP) – procesiranje restrikcijskih encimov.

Vrste ponavljanja:

1. Polimorfizem dolžine kratkega (2-4 nt) enostavnega zaporedja (SSLP);

2. Minisateliti (do 25 nukleotidov) VNTR;

3. mikrosateliti (di- ali tetranukleotidi) STR, SSR;

Polimorfizem enega nukleotida (SNP) v agaroznem gelu;

(AGTCA G AAATC);

(AGTCA C AAATC);

Uporaba DNK čipov z uporabo fotolitoavtografije.

Stekleno podlago obdelamo in nanjo nanesemo nukleotid. 5' konec je blokiran in laserska osvetlitev odstrani blokirni del. Na ta način je mogoče uporabiti na stotine tisoč sond.

Nehibridizirajoči fragmenti se sperejo; določen s pegami (iz fluorescentno označene DNA).

Napake:

1. Omejena ločljivost (največ 1 gen na 3,3 kb pri E. coli in 1 gen na 10 kb pri S. cerevisiae);

2. Omejena ločljivost zaradi neenakomernega prehoda.

Osnovne metode fizičnega kartiranja:

1. Preslikava omejitev;

2. FiSH (fluorescenčna in situ hibridizacija);

3. preslikava STS;

Restrikcijsko kartiranje je določitev relativnih lokacij in specifičnih restrikcijskih mest na genomski karti ter razdalj med njimi.

Značilnosti velikih parcel:

1. Uporaba restrikcijskih encimov, ki prepoznajo 7-8 nukleotidov;

2. Uporaba restrikcijskih encimov, katerih prepoznavno mesto vključuje redke kombinacije nukleotidov;

3. Uporaba posebnih tehnik gelske elektroforeze z izmeničnim električnim poljem za ločevanje velikih fragmentov DNA.

Klasičen pristop je elektroforeza za določanje velikosti fragmentov. Potrebna sta vsaj 2 restrikcijska encima, vsak od njih obdela preučevani fragment DNA.

Prva stvar, ki jo morate narediti, je, da izberete restrikcijski encim, ki reže manj pogosto, tako da dobite primerno število fragmentov. Tukaj so statistično izračunane frekvence mest za različne endonukleaze z različnimi velikostmi mest. Vzamejo se restrikcijski encimi, ki imajo najdaljše mesto, poleg tega pa so na mestih posebej izbrani restrikcijski encimi, ki imajo redke kombinacije nukleotidov. Tako dobimo restrikcijsko reakcijo z razumnim številom fragmentov, vendar moramo še vedno določiti velikost teh fragmentov. Za določitev velikosti velikih fragmentov se uporabljajo posebne tehnike: elektroforeza v izmeničnem polju ali druge vizualizacijske metode, ki jih združujemo pod imenom optično preslikavo. .

Prvič, na ta način lahko najdete encime, ki bodo rezali še redkeje. Zlasti na primeru človeškega genoma to spletno mesto pokaže, zakaj imamo malo kombinacij CG. V človeškem genomu so črke CG, ki se nahajajo ena poleg druge, le v promotorskih regijah. V skladu s tem niso prisotni v večini genoma. Zakaj se to dogaja? Ker je citozin metiliran, tj. dodana je metilna skupina. Tam je bil citozin, izkazalo se je, da je 5-metilcitozin. Vsaka amino skupina v sestavi dušikovih baz je sposobna hidrolize z dokaj visoko verjetnostjo. Ostanek pri hidrolizi je zamenjava amino skupine z okso skupino in če zamenjamo citozin, potem dobimo uracil, ki je enakomerna baza in ga zato sistem popravljanja izloči, če pa je 5- metilcitozin, potem dobimo timin in to je zakonita osnova v DNK. V skladu s tem, če črka C ni kritična na ustreznem mestu genomskega zaporedja, potem je evolucijski pritisk precej hud - zamenjava črke C s črko T. Evolucijski pritisk bo večji v kodirnem zaporedju in promotorskem zaporedju , ker so metilirane sekvence CG pomemben regulativni signal, ki nadzoruje. To so tako imenovane pravice CPGS, kjer te obstajajo, bo skoraj zagotovo aktivirano regulativno področje. Če je torej naloga izbrati redke restrikcijske encime, bo treba izbrati restrikcijske encime, katerih mesto vključuje te kombinacije nukleotidov. Poglejmo, kaj se zgodi .

Ena od možnosti je elektroforeza v pulzirajočem polju. Standardna elektroforeza je zelo slabo primerna za fragmente z več kot 50 tisoč bp. Vsi se zberejo v šop na vrhu gela, se ne ločijo, nekateri pa ostanejo celo v luknjici. Da bi jih ločili, se spremenijo pogoji elektroforeze - dve elektrodi se spremenita v 4 in izmenična napetost se dovaja najprej na eno elektrodo, nato na drugo. Ko je na prvo elektrodo priključena napetost, se fragment DNK premakne na zelo kratko razdaljo in se zatakne v porah agaroze. Napetost se spremeni, tok se dovaja na druge elektrode, fragment DNK se izvleče iz tistih celic, v katerih je obtičal, in se malo premakne, nato se smer spet spremeni. Gibanje se izkaže za cikcak. Toda koraki so zelo kratki in pomenijo linearno gibanje. Pravzaprav je rezultat navadna elektroforeza, razlika je v tem, da bodo veliki fragmenti jasno ločeni, ker mobilnost je popolnoma drugačna. Ni tako togo vezan na maso drobcev. Elektroforeza ima eno veliko pomanjkljivost – ne gre za neposredno merjenje velikosti DNK. Molekularni marker bo tekel po eni od stez in primerjala se bo dolžina teka - posredni indikator.

Tako imenovano optično preslikavo nadomešča elektroforezo, pri čemer se velikost fragmentov meri neposredno. Njegovo bistvo je v tem, da se DNK zravna na enega od več načinov, izvleče se iz zvite krogle. Poleg tega se pod napetostjo razteza. Poleg tega se napetost molekule DNK obdela z restrikcijskim encimom, ko se konci molekule odmaknejo od mesta reza, vse to je mogoče videti pod mikroskopom. Nato tak pripravek pregledamo pod mikroskopom, DNK obarvamo z interkalacijskim fluorescentnim barvilom in vidna so mesta preloma. Neposredno merjenje dolžine pod mikroskopom. Dve možnosti za pridobitev linearne napete DNA: v obeh primerih se uporablja lastnost meje med različnimi fazami. Ko DNA prehaja skozi fazno vezje, se podaljša. Prva tehnika uporablja DNK v staljeni raztopini agaroze. DNK nanesemo na stekelce in čez nekaj časa se agaroza začne strjevati. Otrdelost nikoli ne poteka enakomerno, vedno se začne na nekem mestu. Kristalizacijska fronta agaroze se premakne od začetne točke in se razširi. Ko gre skozi molekulo DNK, to molekulo potegne s seboj in posledično dobimo poravnano molekulo v napetem stanju. Nato se tukaj doda encim, v nekaterih primerih se encim takoj imobilizira na steklu, nato pa se dodajo magnezijevi ioni skupaj z ustreznim pufrom ali morda obratno - nato encim. Toda prva možnost je boljša - bolje se razprši. Druga metoda temelji na dejstvu, da se pokrovček zelo počasi odstrani iz raztopine DNK. Obdela se z raztopino silana, kar poveča sorpcijo DNA, nekaj molekul se sorbira na ta kos stekla in se zelo počasi, nekaj milimetrov na uro, potegne iz raztopine in ko gre skozi film površinske napetosti, se molekule DNK potegnejo navzdol z mesta, kjer so pritrjene. Smer je nasprotna gibanju stekla. Dobimo poravnano molekulo v stresnem stanju, nato steklo obdelamo z restrikcijskim encimom.

V neparnem stanju ni hibridizacije. Odkrivanje SNP-jev s hibridizacijo raztopine. Med hibridizacijo se lasnica odpre.

Naslednja tehnika kartiranja je fluorescentna hibridizacija na preparatih - FISH .

Tukaj je lokus neposredno vizualiziran, v skladu s položajem fluorescentne sonde na kromosomih, obarvanih s citološkim barvilom (zasukani kromosomi). Zdravilo se nanese na steklo, pritrdi nanj in podvrže delni denaturaciji. Posledično dobimo odseke po dolžini kromosoma v enoverižnem stanju. Doda se vzorec, ki se hibridizira s temi območji, nato pa se taka naprava obarva z ustreznimi barvili in mikroskopira. Mikroskopija se izvaja v vidnem območju, fluorescentna mikroskopija. Vzorec obsevamo z laserjem pri določeni valovni dolžini in opazujemo fluorescenco. Posledično dobimo vzorec fluorescence, ki je nadgrajen na vzorcu pasov, ki je značilen za določen kromosom. Naredili smo sondo za točno določen gen in takoj vidimo, kje na kromosomu se ta gen nahaja.

Slabosti: ločljivost je precej nizka, ne več kot 1 milijon n. med sosednjimi conami. Za povečanje ločljivosti se uporabljajo modifikacije tehnik.

Najenostavnejši pravzaprav ne spremeni ničesar - mehansko raztezanje kromosomov. Kromosomski pripravek zavrtimo v centrifugi pri nizki hitrosti. Kromosomi se podaljšajo pod vplivom centrifugalnih sil, glavna stvar je, da ne pretiravate z vrtljaji. Proteini se ne združujejo in ostanejo na mestih, kjer so fiksirani in se lahko obarvajo. Ločljivost se poveča za 4-5. Do 200 tisoč b.p. med sosednjimi oznakami. Če je potrebna višja ločljivost, se uporabljajo druge modifikacije - nemetafazni kromosomi (ločljivost do 20-25 tisoč bp) in fiber-FISH, isti kromosomi, le da so dodatno raztegnjeni - raztezanje v gelu, molekularno "česanje", ločljivost do 10 tisoč n. n. Pomanjkljivost teh dveh metod je, da ne moremo povezati fluorescenčne sonde s citološko karto. Lahko le postavimo 2 sondi relativno eno proti drugi in določimo razdaljo med sondama. Obstajati mora sonda, katere položaj je znan, in istočasno moramo videti to sondo in sondo, ki nas zanima.

Druga metoda preslikave je preslikava STS. . Nekoliko je podoben genetskemu kartiranju, vendar namesto uporabe rekombinacije uporablja drugačen način določanja relativne razdalje. Merilo pri tem je pogostost fragmentacije DNK med gradnjo genomskih knjižnic in fragmentov. Pravzaprav je bistvo enako: molekula DNA se zlomi pod vplivom nizkega ultrazvoka ali pod delovanjem restrikcijskih encimov. razlika je tudi v tem, kaj služi kot marker. Označevalci STS so znani fragmenti DNK, ki se enkrat pojavijo v genomu in zaporedje mora biti znano.

Ko je tako zaporedje znano, lahko izberemo par primerjev znotraj teh 100-500 nt. itd. in pridobijo fragment PCR, s katerim se običajno detektira tak marker. Najenostavnejši način za izbiro zaporedij za pridobitev teh označevalcev je uporaba zaporedij EST - kratkih kosov cDNA, izdelanih iz messenger RNA. Ker gre za kopijo mRNA, je zagotovljeno, da se enkrat pojavi v genomu, saj je večina genov edinstvenih. V skladu s tem je to prvotno edinstveno zaporedje. Drugi markerji, ki so manj priročni, so markerji, polimorfni v preprostih zaporedjih - minisateliti ali mikrosateliti. Uporabite lahko tudi naključna genomska zaporedja, vendar so težja, ker je treba jasno dokazati, da gre za edinstvena genomska zaporedja. Za določitev položaja takšnih markerjev je potrebna še ena komponenta - reagent za preslikavo. To je le niz fragmentov DNK iz določene knjižnice. Bližje ko so markerji drug drugemu na dejanskem zemljevidu kromosomov, večja je verjetnost, da bodo končali v istem fragmentu DNK.

Označevalci so tesno povezani in se nahajajo v bližini, zato se končajo v velikem številu fragmentov. Markerji, ki se nahajajo dlje, najpogosteje padejo na različne fragmente DNK. Če so markerji še bolj oddaljeni, bo razdalja med njimi večja od velikosti fragmentov knjižnice in jih sploh ne bodo zaznali skupaj. Vse to je statistično oskubljeno - na podlagi pogostosti sopojavnosti teh markerjev v knjižnici je mogoče precej natančno določiti razdaljo med njimi na realnem kromosomskem zemljevidu. Pod pogojem, da je razdrobljenost le naključna. Viri fragmentov: standardna knjižnica klonov, niz radiacijskih hibridnih celic.

Radiacijske hibridne celice so najprimernejše za preslikavo STS. To je stara tehnologija, pravzaprav varianta in vivo kloniranja evkariontske DNK. Govorimo o hibridizaciji obsevanih celic z neobsevanimi celicami. Poleg tega so neobsevane celice praviloma celice kitajskega hrčka, obsevane celice pa so celice katerega koli sesalca, vključno z. oseba. Če predpostavimo, da so to človeške celice, so te izpostavljene zelo velikim dozam γ-sevanja in takšna celica postane nesposobna za življenje, dobimo celico z resno fragmentirano DNA in takšne kromosome je nemogoče popraviti. Če je taka celica spojena s celico drugega sesalca, bo sistem za popravilo nepoškodovane celice poskušal popraviti te dvoverižne zlome in rezultat bodo naključne vključitve fragmentov te DNK v različne dele njenih nedotaknjenih kromosomov. Kar ni bilo mogoče vklopiti med celično delitvijo, bo izločeno, tisto, kar je vklopljeno, pa bo podedovano kot standard v tej celični liniji. Ker je v vsakem kromosomu vključenih več fragmentov tuje DNK, je s pravilnim odmerkom sevanja približno 100 celic stotih linij takih hibridomov dovolj za izgradnjo podrobnega STS zemljevida evkariontskega genoma.

S PCR se zabeleži prisotnost markerjev v enem vzorcu DNK in izračuna frekvenca teh markerjev v vseh variantah linij. Obstajajo različni mehanizmi avtomatizacije.

Njegovo bistvo je v tem, da se za detekcijo ne uporablja elektroforeza, ampak fluorescentna oznaka, ki je tu vključena na precej premeten način. Reakciji se dodajo fluorescentni nukleotidi, vendar je detekcijski sistem sposoben zaznati le polariziran signal; signal na začetku ni polariziran - ne pride do detekcije. Situacija se začne, ko je tak nukleotid vključen v DNK. Ti nukleotidi so terminatorji, zato se vklopijo samo enkrat in po vklopu nekoliko drugače fluorescirajo. PCR je prisoten, dodan je še en notranji primer; hibridizira z eno od produktnih verig in ta nukleotid se ji doda. Po tem postane signal polariziran in ga je mogoče zaznati. Če izdelka ni, ne bo signala. S to modifikacijo detekcije PCR je mogoče hitro sestaviti fizični zemljevid genoma v merilu evkariontskega genoma.

Ko smo začeli govoriti o preslikavi sts, sem rekel, da je druga možnost za vir fragmentov za preslikavo le standardna knjižnica klonov. Malo manj priročno je v smislu, da je treba uporabiti veliko več klonov, pogostnost sopojavnosti na enem fragmentu je manjša, vendar je presejanje obsežnejše. Toda obstajajo prednosti, ki vsaj delno kompenzirajo to pomanjkljivost, so, da je mogoče iste klone uporabiti za izdelavo zemljevida in iste klone nato uporabiti za sekvenciranje. Isto knjižnico klonov lahko uporabimo za preslikavo, nato pa še za določitev nukleotidnega zaporedja, zato ni treba ničesar posebej načrtovati, za tako preslikavo pa lahko uporabimo že obstoječo knjižnico klonov.

No, ko je obstajala citologija, so vam morda povedali o principu razvrščanja celic s pomočjo fluorescence, to je, da so te celice obarvane s fluorescentnim barvilom, kar pomeni, da zelo majhna sprememba te tehnike omogoča, da ne odprete celic, ampak kromosomi. In to načelo v skladu s tem omogoča razdelitev celotnega kromosomskega niza na ločene kromosome in nato iz DNK enega kromosoma naredijo knjižnice. To je velika pomoč, ker je ena stvar delati na lestvici genoma s 3 milijardami nukleotidnih parov, druga stvar na lestvici enega kromosoma, potem dobimo povprečje 150 milijonov. Čutite, kako lestvica pada in seveda ta metoda se uporablja. Upam, da si to dobro zapomnite, tukaj je vse izjemno preprosto. Kar je treba razvrstiti, obarvamo s fluorescenčnim barvilom, v tem primeru kromosome. Količina barvila, ki se veže na kromosom, je odvisna od več dejavnikov, najprej od velikosti kromosoma - ta je glavni dejavnik, in drugič od strukture beljakovin, ki so povezane s tem kromosomom. Beljakovine se nekoliko razlikujejo, predvsem se razlikujejo po količini heterokromatina, no, to določa, da ni neposredne korelacije med velikostjo kromosoma in intenzivnostjo obarvanja. No, kaj se zgodi potem, potem raztopina kaplja iz epruvete po majhnih kapljicah, vsaka koncentracija je izbrana tako, da je kapljica ali prazna ali vsebuje en kromosom, v nobenem primeru dva. Nato kapljico od strani osvetli laserski žarek in če je v kapljici prisoten kromosom, se vzbudi fluorescenca, ki jo zazna detektor. Intenzivnost fluorescence je sorazmerna s količino vezanega barvila. Ta količina označuje vsak kromosom na edinstven način; na tej stopnji lahko rečemo, kateri kromosom je v tej kapljici. Nato ta par elektrod v skladu z jakostjo fluorescence napolni kapljico tako, da nastane dokaj močno električno polje. Večja kot je fluorescenca, več naboja dobi kapljica. Kapljica leti naprej in gre skozi naslednji par elektrod. Te elektrode odklonijo kapljico v desno ali levo glede na naboj. Večji kot je naboj, večje je odstopanje v eno smer; na splošno bo odstopal v eno smer in zato bo vsak kromosom kapljal v svojo epruveto. Pravilna izbira barvila pri človeških kromosomih omogoča ločitev vseh parov kromosomov razen enega v ločene epruvete. Za preostali par kromosomov se vzame drugo barvilo, ki se nekoliko drugače veže in tudi ta par lahko ločimo. Tako dobimo preparate posameznih kromosomov iz celotnega DNK preparata, kar bistveno poenostavi nadaljnje delo. Tu končamo s preslikavo in knjižnicami.

Genetsko kartiranje se še vedno uporablja in se bo še naprej uporabljalo, ker ... Poleg sestavljanja zemljevidov genoma ima pomembno aplikacijo - obstaja tehnika selekcije s pomočjo markerjev, ki vam omogoča zelo hitro vnos želenega gena.

Genotip takšne nove sorte iz divjine jasno nadzoruje prisotnost tega gena z molekularnim markerjem. Pomanjkljivost je omejena natančnost. Za E. coli in kvasovke se genetsko kartiranje izvaja že od 50. let in kartiranih je bilo na tisoč genov. V primeru E.coli in kvasovk je največja gostota takih zemljevidov en gen na 3 tisoč bp. pri E. coli in en gen na 10 tisoč bp. v kvasu. V obeh primerih se izkaže, da mogoče je kartirati le vsak tretji, vsak četrti gen. Večje natančnosti ni mogoče doseči. Drugi problem je povezan z dejstvom, da crossing over poteka neenakomerno po dolžini kromosoma, obstajajo vroče točke crossing overja, obstajajo deli kromosoma, ki blokirajo crossing over - to povzroči dodatno napako in poleg tega lahko spremeni položaje nekaterih lokusov na genetski karti. Prav tako se zaradi neprevidnosti poveča število eksperimentalnih napak.

Kartiranje ima 2 nalogi – določiti relativno lokacijo določenih regij na kromosomu, druga naloga pa je določite razdaljo med njimi. Tisti. Kar zadeva relativno lokacijo, se gensko preslikava bolj ali manj spopade s tem; če pogledate na diapozitivu, položaji teh markerjev sovpadajo, razen pri dveh sta zamenjana, očitno je tukaj nekakšna anomalija. Kar zadeva razdaljo med markerji, je tukaj vse nekoliko slabše - vidite, da so nekatere razdalje nekoliko večje, nekatere manjše od dejanskih razdalj. Skladno s tem postajajo vse bolj pomembne tehnike fizičnega kartiranja, ki so zdaj sestavni del genomskega projekta tako v klasičnem pristopu k sekvenciranju kot v pristopu shotgun, saj v večini primerov za odpravo vrzeli v zaključni fazi še vedno ne gre brez zemljevida, zlasti za evkariontske genome.

Kartiranje genov gensko kartiranje, kartiranje- kartiranje genov.

Določanje položaja danega gena na kromosomu glede na druge gene; uporabite tri glavne skupine metod K.g.- fizične (določanje z uporabo restrikcijskih zemljevidov, elektronske mikroskopije in nekaterih variant elektroforeze medgenskih razdalj – v nukleotidih), genetske (določanje frekvenc rekombinacij med geni, zlasti v družinski analizi itd.) in citogenetske (in situ hibridizacija).<in situ hibridizacija>, pridobivanje monokromosomskih celičnih hibridov<monokromosomski celični hibrid>, način brisanja<preslikava izbrisa> itd.); v človeški genetiki so sprejete 4 stopnje zanesljivosti lokalizacije danega gena - potrjena (ugotovljena v dveh ali več neodvisnih laboratorijih ali na materialu dveh ali več neodvisnih testnih predmetov), ​​preliminarna (1 laboratorij ali 1 analizirana družina), protislovno (razhajanje med podatki različnih raziskovalcev), dvomljivo (ni dokončno določen podatek enega laboratorija); Dodatek 5 ponuja povzetek (od leta 1992-93) strukturnih genov, onkogenov in psevdogenov v človeških in - vključno z nekaterimi mutacijami - genomih miši.

(Vir: “Angleško-ruski razlagalni slovar genetskih izrazov.” Arefiev V.A., Lisovenko L.A., Moskva: Založba VNIRO, 1995)

Poglejte, kaj je "kartiranje genov" v drugih slovarjih:

gensko kartiranje- Določitev položaja danega gena na katerem koli kromosomu glede na druge gene; uporabljajo se tri glavne skupine metod K.g. fizikalne (določitev z uporabo restrikcijskih kart, elektronske mikroskopije in nekaterih variant elektroforeze... ...

Kartiranje genov- določitev položaja danega gena na katerem koli kromosomu glede na druge gene. Genetsko kartiranje vključuje določanje razdalj na podlagi frekvenc rekombinacije med geni. Fizično kartiranje uporablja nekaj tehnik... ... Slovar psihogenetike

kartiranje [genov] z uporabo povratnega križanja- Metoda genetskega kartiranja, ki temelji na pridobivanju povratnih križancev sorodnih oblik in analizi cepitve variantnih alelov, ki so polimorfni v dolžinah restrikcijskih fragmentov; Ta metoda je najpogostejša pri kartiranju genov v... ... Priročnik za tehnične prevajalce

Preslikava povratnega križanja [geni] z uporabo povratnega križanja. Metoda genetskega kartiranja, ki temelji na pridobivanju povratnih križancev sorodnih oblik in analizi cepitve različic alelov, ki so polimorfne v restrikcijskih dolžinah... ...

Primerjalno gensko kartiranje sesalcev- * kartiranje genov sesalcev * primerjalno kartiranje genov sesalcev (informativna primerjava genetskih kart človeka in katere koli druge vrste sesalcev). Oba morata biti dobro preučena in daleč narazen ...

Kartiranje- * preslikava * preslikava, ki določa položaje genov ali nekaterih specifičnih mest (glej) vzdolž verige DNK (zemljevid)... Genetika. Enciklopedični slovar

Kartiranje z uporabo obsevanih hibridov [celic]- * kartiranje dapamogay apramenennyh hibridov [celic] * sevano hibridno kartiranje, modifikacija metode genskega kartiranja z uporabo hibridizacije somatskih celic. Celice hibridnega klona "glodalec-človek", ki vsebujejo le kromosom 1 ... ... Genetika. Enciklopedični slovar

Kartiranje radiacijskih hibridov z uporabo obsevanih hibridov [celic]. Modifikacija metode genskega preslikave s hibridizacijo somatskih celic, celice hibridnega klona »glodalec ˟ človek«, ki vsebuje samo 1 kromosom... ... Molekularna biologija in genetika. Razlagalni slovar.

Vzpostavitev vrstnega reda genov in relativne razdalje med njimi v vezni skupini ... Velik medicinski slovar

Kartiranje človeškega genoma

Ni nam treba zaman nadlegovati bogov -

Obstajajo notranjosti žrtev, da ugibamo o vojni,

Hlapci naj molčijo in kamni da zidajo!

Osip Mandelstam, "Narava je enaka Rimu ..."

Genetika je mlada veda. Razvoj vrst je bil zares odkrit šele v poznih 50. letih 19. stoletja. Leta 1866 je avstrijski menih Gregor Mendel objavil rezultate svojih poskusov opraševanja graha. Do konca stoletja nihče ni posvečal pozornosti njegovemu odkritju. In Galton, na primer, nikoli ni vedel zanje. Tudi mehanizem oploditve - zlitje jeder moških in ženskih zarodnih celic - je bil odkrit šele leta 1875. Leta 1888 so v celičnih jedrih odkrili telesca, imenovana kromosomi, leta 1909 pa so Mendelove dejavnike dedovanja poimenovali geni. Prva umetna oploditev (pri zajcu in nato pri opicah) je bila izvedena leta 1934; in končno, leta 1953 je prišlo do temeljnega odkritja - vzpostavljena je bila dvojna vijačna struktura DNK. Kot vidimo, se je vse to zgodilo pred kratkim, tako da so bili zgodnji evgeniki na splošno zelo malo obveščeni o tehnologiji svojega dela.

Kartiranje človeškega genoma je še v zgodnjih fazah. Kar vemo, je majhen delček v primerjavi s tem, česar ne vemo. Obstaja tri milijarde nukleotidnih zaporedij, ki tvorijo od šestindvajset do osemintrideset tisoč genov, ki neposredno kodirajo beljakovine. Toda kako geni in beljakovine, ki jih proizvajajo, medsebojno delujejo, je še vedno slabo razumljeno.

Vendar pa se vloga genov v človeški družbi zaveda precej hitro. Leta 1998 se je Diana Paul (Univerza v Massachusettsu) spomnila, da je štirinajst let prej poklicala

"biološko deterministično" stališče, da na razlike v inteligenci in temperamentu vplivajo geni – z uporabo teh izrazov, kot da bi bil njihov pomen določen. Danes bi bila njihova uporaba sporna, saj se zdi, da te oznake postavljajo to stališče pod vprašaj, medtem ko je splošno sprejeto tako med znanstveniki kot v javnosti.".

Kakor koli že, naše znanje se širi dobesedno vsak dan in v zelo bližnji prihodnosti bomo lahko analizirali z veliko natančnostjo. genetska obremenitev ki jih vsiljujemo prihodnjim generacijam.

Iz knjige Najnovejša knjiga dejstev. Zvezek 1 [Astronomija in astrofizika. Geografija in druge vede o zemlji. Biologija in medicina] avtor

Iz knjige Človeški genom: Enciklopedija, napisana v štirih črkah avtor

Iz knjige Človeški genom [Enciklopedija s štirimi črkami] avtor Tarantul Vjačeslav Zalmanovič

Iz knjige Najnovejša knjiga dejstev. Zvezek 1. Astronomija in astrofizika. Geografija in druge vede o zemlji. Biologija in medicina avtor Kondrašov Anatolij Pavlovič

Iz knjige Dešifrirano življenje [Moj genom, moje življenje] avtorja Venter Craig

Iz knjige Biološka kemija avtor Lelevič Vladimir Valerijanovič

Iz avtorjeve knjige

Iz avtorjeve knjige

I. DEL ZGRADBA ČLOVEŠKEGA GENOMA KAJ JE GENOM? Vprašanja so večna, odgovore določa čas. E. Chargaff V dialogu z življenjem ni pomembno njegovo vprašanje, ampak naš odgovor. M. I. Tsvetaeva Že na samem začetku opredelimo, kaj tukaj mislimo z besedo genom. Ta izraz sam

Iz avtorjeve knjige

Analiza celotne DNK - nove informacije o strukturi človeškega genoma Na prvi stopnji neposrednega raziskovanja strukture človeškega genoma, ko še ni obstajala metodologija genskega inženiringa, so za preučevanje DNK uporabljali tradicionalne fizikalno-kemijske metode. IN

Iz avtorjeve knjige

Iz avtorjeve knjige

DEL II. DELOVANJE ČLOVEŠKEGA GENOMA KRALJICA JE MRTVA - NAJ ŽIVELA KRALJICA! Kar vemo, je omejeno, kar pa ne vemo, je neskončno. P. Laplace Znanost se vedno izkaže za napačno. Nikoli ne bo rešila vprašanja, ne da bi postavila ducat novih. B. Shaw Torej,

Iz avtorjeve knjige

Kako je računalnik uporaben za preučevanje človeškega genoma? Brez računalniških bioinformacijskih tehnologij (genoinformatike ali v širšem smislu bioinformatike) razvoj genomskih raziskav skorajda sploh ne bi bil mogoč. Težko si je celo predstavljati, kako

Iz avtorjeve knjige

DEL III. IZVOR IN RAZVOJ ČLOVEŠKEGA GENOMA

Iz avtorjeve knjige

Kako drugačen je človeški genom od genoma šimpanza? Genom je zbirka genov, ki jih vsebuje haploidni (enojni) nabor kromosomov danega organizma. Genom ni značilnost posameznika, temveč vrste organizma. Februarja 2001 v ameriški

Iz avtorjeve knjige

11. poglavje Dekodiranje človeškega genoma Kaj rečete, ko se z vso silo vzpenjate na vrh gore, na kateri še nihče ni bil, nenadoma zagledate osebo, ki se vzpenja po vzporedni poti? V znanosti je sodelovanje vedno veliko bolj plodno