Структура і особливості регуляції генів гомологів RFP2 у людини і миші Скоблов Михайло Юрійович. Структура і особливості регуляції генів гомологів RFP2 у людини і миші Скоблов Михайло Юрійович Науково-практична значущість роботи

Типи регуляції активності генів у прокаріотів Репресія і індукція синтезу білків у прокаріотів реалізують принципи адаптації до мінливих умов існування і клітинної економії: ферменти з'являються в клітинах, коли в них є потреба, і перестають вироблятися, якщо потреба зникає. Експресуються гени можна поділити на такі категорії: конститутивні, присутні в клітинах в постійних кількостях незалежно від метаболічного стану організму індуковані, їх концентрація в звичайних умовах мала, але може зростати в 100 разів і більше, якщо, наприклад, в середу культивування клітин додати субстрат такого ферменту; репресованих, т. е. ферменти метаболічних шляхів, синтез яких припиняється при додаванні в середу вирощування кінцевого продукту цих шляхів.

Регуляція транскрипції у прокаріот Оперон - функціональна одиниця генома у прокаріот, до складу якої входять цистрони (гени, одиниці транскрипції), що кодують спільно або послідовно працюють білки і об'єднані під одним (або декількома) промоторами. Оперон за кількістю цистрон ділять на моно-, оліго- і поліцістронной, що містять, відповідно, тільки один, кілька або багато цистрон (генів). Концепцію оперона для прокаріотів запропонували в 1961 році французькі вчені Жакоб і Моно, за що отримали Нобелівську премію в 1965 році. Структура лактозного оперона Франсуа Жакоб Жак Люсьєн Моно

Механізм роботи лактозного оперона Клітини Е. coli зазвичай ростуть на середовищі, використовуючи як джерело вуглецю глюкозу. Якщо в середовищі культивування глюкозу замінити на дисахарид лактозу, то клітини адаптуються до нових умов, почавши синтез трьох білків, що забезпечують утилізацію лактози. Один з цих білків - фермент β-галактозидаза, що каталізує гідролітичні розщеплення лактози до глюкози і галактози

Механізм роботи лактозного оперона a) За відсутності індуктора (лактози) білок-репрессор пов'язаний з оператором. РНКполімераза не може приєднатися до промотор, транскрипція структурних генів оперона не йде b) У присутності лактози білок-репрессор приєднує її, змінює свою конформацію і втрачає спорідненість до оператора. РНК-полімераза зв'язується з промотором і транскрибирует структурні гени.

Репресія синтезу білків. Триптофанового оперон. Вище описана система регуляції триптофанового оперона за принципом вкл / викл. Ця система реагує на різні концентрації триптофану, змінюючи швидкість синтезу ферментів біосинтезу в 700-кратної діапазоні Як тільки репресія послаблюється і починається транскрипція, швидкість транскрипції регулюється другим більш тонким регуляторним процесом званим транскрипційних аттенюаціі (transcription attenuation - Транскрипційні ослаблення). Транскрипційні аттенюаціі описана як процес, в якому транскрипція ініціюється як зазвичай, але різко зупиняється перед транскрибується опероном генів. Частота, з якою транскрипція «послаблюється» залежить від наявної концентрації триптофану. Основою даного механізму, розробленої Чарльзом Янофскі, є дуже сильний зв'язок між транскрипції і трансляції у бактерій.

Терминация транскрипції у прокаріот Терминация транскрипції може здійснюватися за двома варіантами: Rho-залежна термінація контролюється Rho білком фактор Rho зв'язується зі зростаючою ланцюгом РНК в місцях p-залежною термінації транскрипції РНК полімераза припиняє елонгацію білок Rho дестабілізує водневі зв'язку між матрицею ДНК і м. РНК , вивільняючи молекулу РНК Rho-незалежна термінація Контролюється послідовністю в ДНК-матриці РНК-полімераза доходить до CGбогатого ділянки Синтезована молекула РНК формує стебло-петлю, за якою розташовано кілька урацілом, що призводить до від'єднання молекули РНК від матриці ДНК.

Репресія синтезу білків. Триптофанового оперон. У лідерних піптіде фенілаланіну вого оперона серед 15 залишків 7 залишків фенілаланіну, а в лідерних піптіде гистидинового оперона - 7 поспіль залишків гістидину.

Регуляція SOS-відповіді SOS-відповідь являє собою индуцируемую реакцію клітин на різку зупинку синтезу ДНК, викликану пошкодженням ДНК, голодуванням клітини або іншими стресовими факторами. Це реакція клітини на критичний стан, що наближає її до загибелі. Ключовими регуляторними елементами є Репрессор Lex. A регулює транскрипцію всіх SOS генів Білок Rec. A здатний зв'язуватися з одноцепочечной ДНК Комплекс Rec. A-ss. DNA призводить до індукції SOS відповіді, сприяючи видаленню Lex. A шляхом його авторасщепленію на два білкових фрагмента

Навіщо потрібна регуляція еукаріотів? В організмі людини є мінімум 400 різних типів клітин, що істотно розрізняються за структурою і функціями

Навіщо потрібна регуляція еукаріотів? Кількість клітин в організмі людини - близько 100. 000 (100 трильйонів, або 1014). При народженні людини в мозку налічується близько 14 мільярдів клітин. Ця кількість не збільшується до самої смерті. Після того, як людині виповнюється 25 років, щодня відбувається скорочення кількості клітин мозку на 100 тисяч.

Гени транскрибируются на різному рівні в різних тканинах Якщо взяти будь-яку тканину, то ми побачимо, що половина генів людини взагалі в ній не експресується, а інша половина має наступний розподіл за рівнями експресії

Різниця між прокаріотів і еукаріот Прокаріоти Еукаріоти Структура геному Проста, в основному кільцевої геном Організовано в хромосоми, нуклеосомна структура визначає доступність ДНК Розмір генома Відносно невеликий Щодо великий Локалізація транскрипції і трансляції поєднану Ядерна транскрипція і цитоплазматическая трансляція Організація генів оперон оперон в еукаріотах, не знайдено. Кожен ген має власний промотор і регулюючі елементи Статус транскрипції за замовчуванням Увімкнути Викл

Транскрипція у еукаріот Транскрипційні фактори (ТФ) можуть впливати на транскрипцію генів через кілька механізмів: В літературі на сьогоднішній день описано +1762 ТФ у людини. У більшості випадків вивчених до теперішнього часу ТФ стимулюють формування комплексу преініціаціі на TATA- боксі за рахунок взаємодії їх транс- активують доменів з компонентами базального транскрипційного комплексу (або безпосередньо, або через коактіватори / медіатори). Деякі ТФ викликають зміни структури хроматину, роблячи його більш доступним для РНК-полімерази. Інші ТФ є допоміжними, створюючи оптимальну конформацію ДНК для дії інших транскрипційних факторів. Відомі ТФ, які пригнічують транскрипцію за рахунок безпосередньої дії своїх пригнічують доменів, або порушуючи спільне функціонування комплексу транскрипційних факторів всередині регуляторної області гена (промотора, енхансера).

Транскрипційні регуляція експресії генів еукаріот Для гена Mir 155 в B -клітинах було знайдено 83 взаємодій промотора гена з різними енхансером. Розподіл виявлених взаємодій «промотор-енхансер»

Транскрипційні регуляція експресії генів еукаріот Interactome maps of mouse gene regulatory domains reveal basic principles of transcriptional regulation. Kieffer-Kwon KR, Tang Z, Mathe E, Qian J, Sung MH, Li G, Resch W, Baek S, Pruett N, Grøntved L, Vian L, Nelson S, Zare H, Hakim O, Reyon D, Yamane A, Nakahashi H, Kovalchuk AL, Zou J, Joung JK, Sartorelli V, Wei CL, Ruan X, Hager GL, Ruan Y, Casellas R. Cell. 2013 Dec 19; 155 (7): 1507 -20.

Транскрипційні регуляція експресії генів еукаріот Транскрипційні регуляція визначає коли повинна відбутися транскрипція і як багато РНК має бути синтезовано. Транскрипційні фактори Енхансери сайленсери Інсулятори Організація і статус хроматину Модифікації гістонів ДНК-метилювання

Епігенетика - область генетики, що вивчає механізми спадковості і мінливості, в основі яких НЕ лежить зміна первинної послідовності ДНК і РНК. (С. Г. Інге. Вечтомов 2004 року) Епігенетична регуляція - процес, що приводить до зміни активності гена без змін в його послідовності, що кодує, яке стабільно успадковується після зникнення фактора, що викликав цю зміну. «Епі» - в перекладі з грецького «над».

Епігенетика Термін «епігенетика» був введений в 40-х роках XX століття для опису змін експресії генів в ході розвитку. Англійський дослідник Уоддінгтон піддавав лялечок дрозофіл теплового шоку і спостерігав зміну патернів жилкования крил у дорослих мух. Змінені фенотип відтворювалися в популяції протягом довгого часу після усунення індукованої їх стимулу, що дало можливість припустити, що вплив певного середовищного фактора протягом критичних періодів розвитку може продукувати фенотипічні зміни, які зберігаються протягом усього життя і навіть можуть переходити в наступні покоління. Уоддіктон назвав цей феномен «генетичної асиміляцією». У сучасній літературі частіше використовують термін «епігенетика».

Епігенетика У 1957 році Конрад Халл Уоддінгтон сформулював концепцію «епігенетичного ландшафту». Процес онтогенезу (індивідуальний розвиток організму) - це простір можливостей, "епігенетичні ландшафт", що представляє собою набір епігенетичних траєкторій, що ведуть від зиготи до дорослого стану організму. Епігенетичні траєкторії в деякій мірі пов'язані між собою. Під впливом різних факторів (внутрішніх і зовнішніх, генетичних і негенетических) можливий перехід з однієї траєкторії на іншу, в зв'язку з чим, на підставі однієї і тієї ж генетичної програми можливе формування безлічі траєкторій онтогенезу (поліваріантність онтогенезу). Траєкторії, які отримують перевагу, Уоддінгтон називав креодамі.

Метилирование ДНК - основний спосіб передачі епігенетичної інформації у рослин і ссавців Чи не порушує здатність комплементарному взаємодії, але стабілізує подвійну спіраль ДНК і розпізнається численними білками

Метилирование цитозину і аденіну Цитозин метіліруется значно частіше, ніж аденін Може відбуватися ферментів "спонтанно" без участі Найбільш ефективно "спонтанно" метіліруется цитозин в мотиві Cp. G

Поширеність метелірованія у різних організмів Об'єкт М. musculus H. sapiens Рослини Комахи (D. melanogaster) С. elegans S. cerevisiae N. crassa Наявність метилування є незначно роль невідома немає є

Частоти динуклеотидів у людини Frequencies of dinucleotides in human 10. 00 9. 00 8. 00 7. 00 6. 00 5. 00 4. 00 3. 00 2. 00 1. 00 0. 00 AA AT AG AC TA TT TG TC GA GT GG GC CA CT CG CC Part of human dinucleotides different from a chimpanzee 25. 00 20. 00 15. 00 10. 00 5. 00 0. 00 AA AT AG AC TA TT TG TC GA GT GG GC CA CT CG CC студентка третього курсу ФМБФ МФТІ Світлана Овчинникова

Дезаминирование метилування цитозину В результаті "спонтанного" дезаминирования метилованого цитозину виникає тимін, що призводить до мутації, що закріплюється при реплікації ДНК Те ж саме відбувається в геномах in vivo, результат - елімінація мотивів Cp. G (у рослин - Cp. Np. G)

Cp. G острівці Визначення Cp. G острівця: Frommer (1987) Any stretch of DNA greater than 200 bp with a GC content of greater than 50% and an observed to expected Cp. G ratio of greater than 0. 5 Takai (2002) Any stretch of DNA greater than 500 bp with a GC content of greater than 55% and an observed to expected Cp. G ratio of greater than 0. 6\u003e 200 пн, довжина більшості острівців - 0. 5 -3 т. П. Н. Відносно високий GC-складу (\u003e 50, зазвичай\u003e 60%), щільне розташування мотиву Cp. G (один на 10 пн, в 10 -20 разів вище, ніж в середньому по геному) і його статистична зустрічальність Як правило, містять мотиви CCGCCC (сайти зв'язування транскрипційного фактора SP 1) У людини - близько 45000 острівців. 60% генів мають з своєму локусе Cp. G як мінімум один острів. Практично у всіх генів "домашнього господарства".

Властивості Cp. G острівців Cp. G острівці розташовуються з основному в промоторах і 5 'районах генів Також часто поширені і внутрігенних, що не захоплюючі старт транскрипції Існують і міжгенних Cp. G острівці

Властивості Cp. G острівців Cp. G-острівці або гіпометіліровани гіперметіліровани, або Cp. G в промоторах зазвичай неметіліровани, що необхідно для транскрипції відповідного гена (метилювання, як правило, призводить до блоку транскрипції) Встановлений статус метилювання, як правило, стабільний і надалі підтримується.

Механізми репресії транскрипції, обумовленої метилированием. Прямий механізм 1. метильних груп порушують ДНК-білкові взаємодії, виступаючи в більшу борозенку ДНК і перешкоджаючи зв'язуванню специфічних транскрипційних факторів. 2. Деякі ТФ навпаки мають підвищену спорідненість до етиловому сайтам. Чутливі до метилированию AP-2, E 2 F, NFk. B, CREB, Myc / Myn Нечутливі до метилированию SP-1, CTF Опосередкований механізм 3. метилірованої райони ДНК пов'язують MBD (methyl binding domain) - містять білки, які залучають транскрипційні репрессори або білки, що модифікують гістони. - Більшість MBD містять білків - репрессори або корепрессора транскрипції. - У Arabidopsis ім. 12 MBD - містять білків. - МBD - містять білки можуть формувати комплекси з деацетілазамі гістонів (репресор).

У клітинах ссавців діють принаймні дві системи метилювання, за які відповідають різні метилаза Метилирование de novo вносить елементи мінливості в профіль метилювання Підтримуюче метилювання забезпечує підтримку вже сформованого профілю Підтримуюче метилювання активується при кожному клітинному розподілі

Метилирование ДНК: основні функції Підтримка структури хроматину і стабільності хромосом сайленсінг повторених і інтегрованих чужорідних послідовностей Механізм захисту проти ефектів вбудовування чужорідної ДНК високо метиловані: Сателіти і інші повторювані послідовності Транспозони, провірусні копії Послідовності, характерні для гетерохроматина Тканеспеціфічное неуспадковане довгострокове придушення експресії генів на рівні транскрипції формування профілю експресії, характерного для даного типу клітин високо метиловані: транскрипційні неактивні гени (в гаметах - все, крім експрессіруемих гаметоспеціфічно) гени "пухлинної інвазії" та інші онкогени імпринтовані гени гіпометіліровани: транскрипційно активні гени безпосередній вплив метилування на рівень експресії гена далеко не завжди зрозуміло

Хвилі деметилирования в ранньому ембріогенезі Після запліднення батьківський геном активно деметилюється, в той час як материнський геном пасивно деметилюється. На стадії імплантації ембріона патерни метилування відновлюється de novo для обох батьківських геномів. Після встановлення специфічні патерни метилування підтримуються в поколіннях клітин, забезпечуючи специфічність експресії генів Таким чином, при зміні поколінь відбувається послідовне циклічне метилювання / деметилювання по безлічі позицій в геномі

Деметилювання ДНК глобальний характер ссавці - ранні етапи розвитку зародка, старіння cпеціфіческій геномної імпрінтінг ДНК-деметілазу до сих пір не виявлено

Біологічні функції метилірованої ДНК генома импринтинг інактивація Х-хромосоми регуляція структури хроматину регуляція генної експресії реплікація ДНК канцерогенез клітинне диференціювання вимикання трансгенів ( "silencing")

Метилирование при раку Пухлинні процеси гіперметілірованіе характеризуються ключових інактивацією генів-супресорів і за допомогою гіпометілірованіе активацією цілого ряду онкогенів (raf, c-fos, c-myc, c-Haras, cK-ras), факторів росту (IGF 2, TGF) і мобільних повторюваних елементів, розташованих в районах гетерохроматина.

У геномі присутні Ділянки, вільні від нуклеосом Активні для транскрипції, сайти зв'язування транскрипційних факторів, регуляторних білків Ділянки, де становище нуклеосоми строго фіксоване +1 нуклеосома в генах (дріжджі - від +1 нуклеотиду, хребетні - від +60) Ділянки, в яких нуклеосомна укладка схильна до регуляції білками АТФ-залежного ремоделінг хроматину

Пост-трансляційні модифікації гістонів регуляторних N-решт Ацетилювання лізин (K) Метилирование лізин (K) аргінін (R) Фосфорилування серин (S) треонин (T) Убіквітінілірованіе лізин (К) ADP-рібозілірованіе Сумоілірованіе

Роль пост-трансляційних модифікацій гістонів Зміна електростатичного взаємодії між гистонами і ДНК: Полі. АДФрібозілірованіе призводить до того, що гістони або негістонові білки набувають великий негативний заряд і відвалюються від ДНК Ацетилювання гістонів також вносить негативний заряд, послаблюючи взаємодію ДНК-нуклеосома

Принцип роботи "гістонові коду" Амінокислотний залишок в гістонів модифікує фермент Білок, який "сприймає" модифікацію

Спадкування гістонові коду Під час реплікації нуклеосоми розбираються на димери і видаляються з ДНК, а потім збираються на ДНК знову. Для двох дочірніх ланцюгів потрібно в два рази більше нуклеосом. Частина нуклеосоми під час реплікації збирається по напівконсервативним принципом (наприклад, якщо один димер H 3 H 4 «старий», то другий - знову синтезований). Знову синтезовані гистони будуть модифікуватися за зразком «старих».

Зміни Генетичні Як правило незворотні (мутації) зміни первинної структури ДНК Стабільно успадковані Епігенетичні Як правило оборотні Чи не зачіпають змін первинної структури ДНК Бувають довгострокові і короткочасні Безліч взаємопов'язаних механізмів Можуть виникати як випадково, так і специфічним чином у відповідь на певні зміни середовища Епімутація Передбачається, що епімутаціі виникають в 100 разів частіше, ніж генетичні мутації

Епімутація Той же самий ген але різна скрученность хвоста PLo. S Biol 1: 3 (2003)

Перше «повногеномне» дослідження епігеномом людських клітин Розшифровано Епігеном ембріональних стовбурових клітин людини і клітин сполучної тканини легенів (фібробластів). Епігеном - сукупність станів метилування генома і модифікацій гістонів

Дослідження епігеномом Дослідження 80 пар однояйцевих близнюків у віці 3 -74 року Чим старше досліджувана пара, тим більша різниця в їх профілях метилування і ацетилювання гістонів, що призводило в істотній різниці в паттерне експресії генів

Епігенетика і клонування При клонуванні триколірної кішки ніколи не вийде кішка ідентичного забарвлення, так як малюнок визначається випадковою плямистістю і випадкової інактивацією одного з алелей гена, що визначає забарвлення (чорний / коричневий), в Х-хромосомі Ім'я кішки Сісі ( "cc") від слова "copycat" ...

Епігенетика і канцерогенез В пухлинних клітинах патерн епігенетичних модифікацій значно різниться від такого в нормальних клітинах

Епігенетика і старіння Чим довше характерна тривалість життя у виду тварини, тим повільніше знижується у цього виду рівень метилування з віком Формування аберрантних патернів метилювання: гіпометілірованіе в старіючих клітинах і тканинах (в цілому) але: гіперметілірованіе Cp. G-острівців в старіючих клітинах і тканинах Такі ж різноспрямовані зміни метилювання характерні для ракових клітин 88 сайтів близько 80 генів для яких ступінь метилування високо корелювала з віком

Епігенетика і старіння Цікавий факт: Робоча бджола живе 6 тижнів, а бджоломатка - 6 років. Генетично вони ідентичні. Розрізняються лише тим, що майбутню Бджоломатки під час розвитку годують маточним молочком на кілька днів більше, ніж звичайну робочу бджолу. В результаті у представників цих бджолиних каст формуються дещо відмінні епігенотіпи. І, не дивлячись на зовнішню і біохімічне подобу, тривалість їх життя різниться в 50 разів!

Рівні епігенетичної регуляції 1. ДНК (геном) 2. РНК (транскриптом) регуляторні мотиви пре-м. РНК, антисмислового РНК, нетранслірующіеся РНК, мікро РНК, дволанцюжкові РНК 3. Білки (протеом) метилювання, повторювані послідовності, мутації віддалених регуляторних елементів, транспозиції генетичного матеріалу метилювання / деметилювання лізину 4 і 9 гистона Н 3, ацетилювання / деацетилювання гістонів?

Посттранскрипційна регуляція експресії генів еукаріот посттранскрипційна регуляція включає в себе механізми контролюючі або регулюють м. РНК після синтезу. Альтернативний сплайсинг Швидкість транспорту м. РНК через ядерну мемрану Час життя м. РНК РНК-РНК взаємодії

Час життя РНК Аналіз альтерантівной изоформ генів дріжджів показав серед них високу гетерогенність часу життя. Було знайдено 560 стабілізуючих м. РНК елементів і 851 дестабілізуючих Одним з таких елементів, широко зустрічається серед м. РНК виявилася poly. U послідовність недалеко від 3 'кінця, що приводить до утворення вторинної структури з poly. A хвостом. Global Analysis of m. RNA Isoform Half-Lives Reveals Stabilizing and Destabilizing Elements in Yeast. Joseph V. Geisberg, Zarmik Moqtaderi, Xiaochun Fan, Fatih Ozsolak and Kevin Struhl. Cell, Volume 156, Issue 4, 812 -824, 13 February 2014

Новий клас ce. RNA Якщо одна mi. RNA може регулювати експресію сотень РНК, то експресія цих РНК виявляється пов'язаної ce. RNA - competitive endogenous RNA - конкурентні ендогенні РНК

RNA-mediated gene activation Авторами було вперше показано, що при використанні si. RNA комплементарної промоторному ділянці призводить до збільшення експресії гена в кілька разів У той же час тільки використання неповністю комплементарної si. RNA (MM - mismatched) не мала такого дії Також було показано, що цей процес відбувається за участю білка Ago 2 Involvement of argonaute proteins in gene silencing and activation by RNAs complementary to a non-coding transcript at the progesterone receptor promoter. Yongjun Chu, Xuan Yue, Scott T. Younger, Bethany A. Janowski and David R. Corey. Nucl. Acids Res. (2010) 38 (21): 7736 -7748.

RNA-mediated gene activation Не тільки за допомогою si. RNA, але і за допомогою mi. RNA В іншому дослідженні було показано що mi. R-205 транскрипційно активує гени супресори пухлинного росту IL-24 і IL-32, через комплементарні послідовності в їх промоторах, що призводить до збільшення експресії як на рівні м. РНК так і на рівні білка. Micro. RNA-205 -directed transcriptional activation of tumor suppressor genes in prostate cancer. Majid S, Dar AA, Saini S, Yamamura S, Hirata H, Tanaka Y, Deng G, Dahiya R. Cancer 2010 року; 116: 5637 -49;

Природні антисмислового транскрипти Парою смисловий-антисмислової транскрипти називається пара чиї послідовності м. РНК комплементарні. Цис-антисмислової транскрипт експресується в одному геномном локусе зі смисловим транскриптом. Транс-антисмислової транскрипт експресується з іншого геномного локусу ніж смисловий транскрипт. цис-ПАТ транс-ПАТ

Перекриваються природні антисмислового транскрипти Сходяться (кінець до кінця) Розходяться (голова до голови) неперекривающіхся природні антисмислового транскрипти Понад 70% цис-ПАТ мають сходиться тип (перекривання 3 'кінців), в той час як лише 15% мають розходиться тип. Решта 15% належать ПАТ з повним перекриванням або з відсутністю такого (Інтрон). Орієнтація ПАТ кінець до кінця є в 5 разів більше еволюційно консерватіной.

Зустрічальність цис-ПАТ в декількох еукаріотичних організмах Види перекриваються транскрипти Всього транскриптов Частка (%) Human 5, 880 26, 741 22 Mouse 12, 519 43, 553 29 Rat 548 11, 332 5 Chicken 356 7, 390 5 Drosophila 2, 054 13 , 379 15 Rice 1, 374 20, 477 7 Arabidopsis 2, 680 29, 993 9 Nematode 76 14, 406 0. 5 Yeast 610 7, 598 8

Природні антисмислового транскрипти смисловий - sense умовний розподіл антисмислової - antisense Фактично ми маємо РНК-РНК взаємодія, яке може мати функціональне значення, а може і не мати його.

Транскрипційні інтерференція РНК маскування Двох-цепочечную РНК-залежне замовчування Моделювання хроматину Негативна регуляція Механізми регуляції експресії генів за допомогою патова

Позитивна регуляція антисмислового транскрипт антисмислового транскрипт до гену Zeb 2 маскує сайт сплайсингу і призводить до утримання інтрона в пре-м. РНК смислового гена, що змінює характер ініціації трансляції та супроводжується значною її активацією. Стабілізація або активація експресії смислового транскрипта p 53 за допомогою антисмислової РНК Wrap 53. Показано що in vivo формування дуплекса між смисловим і антисмислового транскрипт в області 5'-нетрансльовані області м. РНК TP 53, що викликає як транскрипційного, так і трансляційну активацію експресії смислового гена p 53. Нокдаун Wrap 53 веде до значного зниження рівня смислової м. РНК і супрессии активації білка p 53 при пошкодженні ДНК. І навпаки, при гіперекспрессіі Wrap 53 підвищується рівень м. РНК смислового гена, і клітини стають більш чутливі до p 53 -опосредованному апоптозу.

Src \u003d "https://present5.com/presentation/79093091_357628544/image-85.jpg" alt \u003d "(! LANG: Вивчення принципів регуляції антисмислового транскрипт антисмислового регуляція Негативна Позитивна AS ═\u003e S ↓ AS ═\u003e"> Изучение принципов регуляции антисмысловыми транскриптами Антисмысловая регуляция Негативная Позитивная AS ═> S↓ AS ═> S Отсутствие!}

Некодуючі TINCR РНК При дослідженні транскріптома клітин попередників і диференційованих кератиноцитів була знайдена linc. RNA змінює експресію в 150 разів. TINCR знаходиться на 19 хромосомі, складається з 3 екзонів загальною довжиною 3, 7 Кб. Для РНК TINCR були зроблені експерименти по pull-down і знайдено 1814 взаємодіючих РНК і білок STAU 1, відомий як РНК-зв'язуючий білок. Також був проведений нокдаун TINCR і знайдено 419 генів змінили експресію більш ніж в 2 рази. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Kretz M, Siprashvili Z, Chu C, Webster DE, Zehnder A, Qu K, Lee CS, Flockhart RJ, Groff AF, Chow J, Johnston D, Kim GE, Spitale RC, Flynn RA, Zheng GX, Aiyer S, Raj A , Rinn JL, Chang HY, Khavari PA. Nature. 2013 Jan 10; 493 (7431): 231 -5.

Некодуючі TINCR РНК Таким чином, було виявлено перший РНК-інтерактив для РНК TINCR Цікаво, що перетин між РНК виловленими (1814) і РНК змінили експресію при нокдауні TINCR (419), склали 56 генів. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Kretz M, Siprashvili Z, Chu C, Webster DE, Zehnder A, Qu K, Lee CS, Flockhart RJ, Groff AF, Chow J, Johnston D, Kim GE, Spitale RC, Flynn RA, Zheng GX, Aiyer S, Raj A , Rinn JL, Chang HY, Khavari PA. Nature. 2013 Jan 10; 493 (7431): 231 -5.

Некодуючі p 21 РНК При пошуку генів змінюють експресію при різних умовах індукції p 53 у миші було знайдено близько 40 linc. RNA Одна з них p 21 - містила 2 екзона довгою 3. 1 Kb. Експериментами pull-down був знайдений белокрепрессор hn. RNP-K зв'язується з р21 Шляхом делеционного аналізу був знайдений ділянку в 780 нуклеотидів в 5'-кінця необхідний для зв'язування з hn. RNP-K. 280 нуклеотидів в ньому мають високу консервативність і формують стабільну вторинну структуру. Серією експериментів показано що p 21 взаємодіючи з hn. RNP-K пригнічує експресію близько 1, 5 тисячі генів, з промоторами яких здатний зв'язуватися з hn. RNP-K A large intergenic noncoding RNA induced by p 53 mediates global gene repression in the p 53 response. Huarte M, Guttman M, Feldser D, Garber M, Koziol MJ, Kenzelmann-Broz D, Khalil AM, Zuk O, Amit I, Rabani M, Attardi LD, Regev A, Lander ES, Jacks T, Rinn JL. Cell. 2010 Aug 6; 142 (3): 409 -19.

Некодуючі p 21 РНК На клітинах He. La було показано що linc-p 21 взаємодіє з Hu. R, збільшуючи швидкість її деградації. Hu. R є широко-Експресується РНКсвязивающім білком, здатним впливати на клітинну проліферацію, виживання, канцерогенез, стрес і імунну відповідь. Експерименти по pull-down показали що з p 21 взаємодіє також білок Ago 2, який також бере участь з Hu. R в деградації p 21. Знаючи, що Hu. R бере участь в репресії b-Катенін (CTNNB 1) і Jun. B (JUNB), автори вирішили перевірити участь в цьому р21. Біоінформатіческій аналіз показав, що р21 має з b-Катенін 15 комплементарних ділянок а Jun. B - 8, розміром від 15 до 33 нуклеотидів, що підтвердили експерименти по pull-down. Експерименти по pull-down виявили два трансляційних репрессора - Rck і FMRP. Надалі для Rck було показано, що в присутності p 21 білок Rck пригнічує трансляцію b-Катенін і Jun. B. Linc. RNA-p 21 suppresses target m. RNA translation. Yoon JH, Abdelmohsen K, Srikantan S, Yang X, Martindale JL, De S, Huarte M, Zhan M, Becker KG, Gorospe M. Mol Cell. 2012 Aug 24; 47 (4): 648 -55.

Некодуючі p 21 РНК Linc. RNA-p 21 suppresses target m. RNA translation. Yoon JH, Abdelmohsen K, Srikantan S, Yang X, Martindale JL, De S, Huarte M, Zhan M, Becker KG, Gorospe M. Mol Cell. 2012 Aug 24; 47 (4): 648 -55.

Трансляційна регуляція експресії генів еукаріот Трансляційна регуляція включає в себе механізми запобігають синтез білка. Як правило, дуже часто мова йде про білкових факторах необхідних для трансляції Запобігання рибосом від зв'язування з м. РНК Фактори ініціації трансляції

Посттрансляційна регуляція експресії генів еукаріот Посттрансляційна регуляція включає в себе механізми діють на білок після його синтезу. Активація білків Деякі білки не активні після синтезу, вони повинні пройти пострансляціонніі модифікації Багато білків активуються після фосфорилювання Feedback Control Деякі ферменти в метаболічних шляхах можуть бути негативно інгібіровані продуктами цього ж шляху Деградація білків

молекулярна біологія

Лекція 3. Функції нуклеїнових

кислот. Частина 1.

Скоблов Михайло Юрійович

Частина 1. Історія дослідження

функції ДНК

походження ДНК

Позаземне?

Експеримент Міллера - Юри

Вчені з NASA проаналізували склад

12 багатих вуглецем метеоритів, 9 з

яких знайдені в Антарктиці. У них були

виявлені компоненти ДНК такі як

аденін, гуанін, а також і інші

Теорія хімічної еволюції

клітинні компоненти - гипоксантин і

Історія вивчення ДНК

У 1869 році Фрідріх Мішер виявив невідомий з'єднання, що міститься в ядрах клітин, і назвав його нуклєїнах, від латинського nucleus - ядро.

Експеримент Евері, Маклеода і Маккарті по трансформації бактерій. 1944 р

Історія вивчення ДНК Експеримент Евері, Маклеода і Маккарті по трансформації бактерій. 1944 р

Друга серія ... ..

висновок:

Тільки ДНК визначає спадкові властивості організму.

Реалізація ДНК як генетичного матеріалу У кожного живого організму є спадковий матеріал Реалізація ДНК як генетичного матеріалу Розмір генома людини 3,2x109 нуклеотидних пар, з нього близько 1.5% генома кодує білки А решта?

Реалізація ДНК як генетичного матеріалу Прокаріоти і віруси Щільність генів, ген / тис.нукл.

Еукаріоти Розмір генома, тис. Нукл.

Реалізація ДНК як генетичного матеріалу Гени організовані по різному: Розмір генома людини 3,2x109 нуклеотидних У прокаріотів: пар, з нього близько 30% генома кодує гени Ген А що кодують білки А решта?

мРНК гена А "junk DNA"?

У еукаріот:

Ген А мРНК гена А Реалізація ДНК як генетичного матеріалу

парадокс:

З еволюційної складністю організму зростає і частка ДНК не кодує білки ... Реалізація ДНК як генетичного матеріалу Структура геному людини Інформаційна ємність ДНК Демонстрація записи тексту цілої книги Черча в 1 пикограмм молекул.

- & nbsp- & nbsp-

Інформаційна щільність запису 2,2 петабайта на 1 грам біологічного матеріалу.

На сьогоднішній день вартість кодування інформації в ДНК оцінюється приблизно в $ 12400 за мегабайт, вартість зчитування - $ 220 за 1 МБ.

Частина 2. Функції ДНК Аналіз первинної структури ДНК і її функції

- & nbsp- & nbsp-

Отримані дані дозволяють провести фактично повноцінний аналіз по дослідженню регуляції досліджуваного локусу.

Знайти ген - значить картировать РНК на ДНК, Гени проаннотіровать цю послідовність.

«Ген - це сукупність геномних послідовностей, що кодують зчеплений набір потенційно перекриваються функціональних продуктів».

Гени псевдоген. Класифікація.

- & nbsp- & nbsp-

Утворені 10% кодують генів

Близько 80% приматів-специфічні

Значна фракція псевдогенов (до 20%) транскрипційно активна ... Механізми дії процессірованной псевдогенов псевдоген і miRNA "PTEN is a functionally haploinsufficient tumour suppressor gene".

- & nbsp- & nbsp-

Енхансер (enhancer) - послідовність ДНК, здатний зв'язуватися з факторами транскрипції, при цьому збільшуючи рівень транскрипції гена або групи генів.

Сайленсери (silencer) - послідовність ДНК, з якою зв'язуються фактори транскрипції (білки-репрессори), що призводить до зниження або до повного придушення транскрипції гена.

Інсулятор (insulator) - послідовність ДНК, здатна блокувати взаємодію між енхансером і промотором, якщо знаходиться між ними.

Регуляторні ділянки в геномі Рівень експресії гена є результуючої всіх взаємодій.

Регуляторні ділянки в геномі

Проаналізовано 19 тканин і типів клітин миші

Знайдено близько 300 000 цис-регуляторних елементів

Вони складають до 11% генома миші

І включають в себе більше 70% консервативних НЕ-кодують послідовностей Регуляторні ділянки в геномі

- & nbsp- & nbsp-

Однак порівняння їх активного стану в ембріональних стовбурових клітинах миші і людини показало, що тільки 25% відсотків активних енхансером і інсуляторов консервативні.

Повторювані послідовності в ДНК

- & nbsp- & nbsp-

Gonzaga-Jauregui C, Lupski JR, Gibbs RA.

Human genome sequencing in health and disease.

Annu Rev Med. 2012; 63: 35-61.

Функціонування вторинної структури ДНК Квадруплекси - послідовності нуклеїнових кислот, збагачені гуаніном і здатні утворювати структури з двох, трьох або чотирьох ланцюгів.

У геномі людини налічується близько 300 тисяч квадруплексов.

ДНКазіми

Вперше дезоксірібозіми були експериментально продемонстровані в 1994 Брікер і Джойсом

Вони використовували селекцію in vitro для пошуку специфічних ДНК послідовностей здатних каталізувати Pb2 + -залежне розщеплення фосфодіефірних зв'язку в РНК

Сьогодні в літературі описано велика кількість різних каталітичних молекул ДНК здатних розщеплювати, лігувати, фосфорилювати деапурінізіровать молекули ДНК, метилірованої порфірини, розщеплювати і лігувати молекули РНК.

Також в літературі описано кілька десятків випадків використання in vivo РНКрасщепляющіх дезоксірібозімов для придушення експресії генів з орієнтуванням на майбутній прикладної потенціал.

Вступ

1. Введення 4

1.1. Актуальність проблеми 4

1.2. Мета і завдання дослідження 4

1.3. Наукова новизна 5

1.4. Науково-практична значущість роботи 6

1.5. Обгрунтування постановки теми дисертаційної роботи 7

2. Огляд літератури 9

2.1. Принципи регуляції експресії генів у еукаріот Основні елементи 9

2.1.1. промотори 9

2.1.2. енхансери 20

2.1.3. Транскрипційні фактори 25

2.1.4. Регуляція експресії генів за допомогою антисмислових РНК

2.2. Порівняння регуляторних частин у гомологічних генів 45

3. Матеріали та методи 51

3.1. Матеріали та обладнання 51

3.2. методи 53

4. Результати та обговорення 66

4.1. Визначення нуклеотидної послідовності промоторной області гена людини RFP2

4.2. Комп'ютерний аналіз промоторной області гена людини RFP2.

4.3. Функціональна характеристика промоторної регіону гена людини RFP2

4.4. Потенційні регуляторні елементи промоторной області гена людини RFP2

4.5. Встановлення структури гена миші Щр2 85

4.6. Порівняльний аналіз області гена RFP2 у людини і миші 88

Загальний висновок 90

Список цитованої літератури. 93

Введення до роботи

1.1. Актуальність проблеми.

Пухлинні захворювання є однією з провідних за частотою груп хвороб людини і однією з основних причин смертності дорослого населення. Імовірність виникнення і інтенсивність прогресії пухлин залежать від генотипу індивіда і від соматичних мутацій, що виникають в процесі індивідуального розвитку. Важливим генетичним бар'єром на шляху виникнення і прогресії пухлин є гени-супресори пухлин. Мутації в цих генах «запускають» пухлинний процес і етапи його прогресії. вивчення тонкої структури і регуляції генів супресорів у людини необхідні для розуміння генетичного контролю норми, яка визначається цими генами, і молекулярно-генетичних механізмів виникнення і прогресії пухлин. Тому проведення таких досліджень є високо актуальним.

Такі дослідження стали можливі в останні роки в результаті реалізації всесвітньої і російської програм геном людини. Дослідження тонкої структури і функціонування окремих областей геному проводять сьогодні шляхом зіставлення даних про структуру геному людини в нормі з даними про його структуру при патологічному пухлинному процесі, а також на основі даних порівняльної геноміки. Такий підхід став можливим лише в самий останній час, і бвл використаний в ході здійснення даної дисертаційної роботи.

1.2. Мета і завдання дослідження.

Метою дослідження було вивчення структурно-функціональних особливостей регуляторного району гена RFP2 людини, як найбільш ймовірного гена супрессора пухлинного росту, розташованого в області ql4 хромосоми 13.

Для реалізації поставленої мети вирішувалися наступні завдання:

1. Визначити нуклеотидну послідовність промоторної регіону гена RFP2 людини і точку ініціації транскрипції для цього гена.

2. Провести біоінформатіческій аналіз промоторной області та виявити потенційні елементи регуляції транскрипції гена RFP2

3. Виявити і провести аналіз спектра потенційних сайтів зв'язування транскрипційних факторів і список самих транскрипційних факторів, взаємодіючих з регуляторної областю гена RFP2 у людини

4. Мінімізувати промоторних область гена RFP2 людини і експериментально локалізувати потенційні регуляторні елементи цього гена.

5. Визначити нуклеотидну послідовність промоторної регіону гена RFP2 миші і провести біоінформатіческій порівняльний аналіз послідовностей нуклеотидів промоторних районів гена RFP2 людини і миші і, таким чином, виявити причини подібності спектрів тканеспеціфічності експресії гена RFP2 у людини і миші.

1.3. Наукова новизна.

Вперше визначена і зареєстрована в GenBank (AF363782) послідовність нуклеотидів довжиною 3,6 т.п.н містить промоторних регіон гена людини RFP2. Експериментально визначено положення точки ініціації транскрипції гена RFP2. Вперше проведено комп'ютерний аналіз промоторной області гена RFP2 людини і виявлені потенційні елементи регуляції цього гена: GC-бокс і сайти зв'язування транскрипційних факторів. Виявлено унікальна особливість структури промотора гена RFP2: в транскрибируемой нитки ДНК перед GC-боксом розташований недосконалий повтор структури GnA довжиною 280 п.н. Виявлено асиметрія в розподілі кількості сайтів зв'язування транскрипційних факторів в області недосконалого повтору: близько 200 сайтів знаходяться в транскрибируемой нитки ДНК, а в нитки, комплементарної цій ділянці, сайти зв'язування відсутні. Вперше за допомогою люціферазних конструкцій локалізовані чотири регуляторних елемента промотора гена RFP2: базальний промотор, енхансер, сайленсери і ділянку, що відповідає за стабільність мРНК гена RFP2. Визначено потенційні сайти зв'язування транскрипційних факторів у ділянках промотора гена RFP2, імовірно містять енхансер і сайленсери. Проведено порівняльний комп'ютерний аналіз послідовності нуклеотидів промоторной області гена RFP2 людини і миші. Виявлено розрив сінтеніі хромосом людини і миші безпосередньо перед білок-кодує областю гена, яка залишається гомологичной у людини і миші. Експериментально виявлено дві ізоформи гена миші ортологічного гену RFP2 людини. Вперше за допомогою біоінформатіческого аналізу в регуляторній частині гена RFP2 у миші виявлено набір 20 потенційних сайтів зв'язування для 18 факторів транскрипції, що відносяться до 11 родин. Проведено порівняльний аналіз наборів сайтів зв'язування транскрипційних факторів і самих транскрипційних факторів у регуляторній області генів RFP2 у миші і людини.

1.4. Практична значимість.

Встановлення послідовності нуклеотидів промоторной області потенційного гена супрессора пухлин RFP2 практично корисно в якості основи для мутаційного скринінгу пошкоджень цього гена в групах пацієнтів з пухлинними захворюваннями, що супроводжуються втратою області генома 13q 14.

1.5. Обгрунтування постановки теми дисертаційної роботи.

Проте, саме в цій групі хворих втрата області генома 13ql4 є найбільш частою (до 80% в деяких вибірках).

Однією з можливих мішеней для мутацій, инактивирующих ген, є його регуляторна область. Для проведення мутаційного аналізу цієї області у хворих необхідне знання її структури і принципів її регулювання в нормі. Структура промоторной області в разі гена RFP2 людини була невідома до початку даної роботи, хоча перша версія чорновий послідовності генома людини на той час вже була доступна. Крім того, структура регуляторноі області гена впливає на тканинний спектр його експресії. Тому інформація про структуру регуляторноі області пухлинних супресорів, необхідна для розуміння молекулярних механізмів виникнення і прогресії пухлин, асоційованих з втратою області 13ql4, в тому числі множинної мієломи і карциноми простати.

Подання про важливість окремих елементів регуляторної області може бути отримано на основі порівняльного аналізу регуляторних областей ортологічних генів у споріднених видів. Було відомо, що спектри тканеспеціфічності експресії генів RFP2 людини і миші подібні, що дозволяло сподіватися на більше розуміння механізмів регуляції тканеспеціфічності цього гена при порівняльному аналізі структур його регуляторних областей у двох видів. Структура кодує області мишачого ортолога гена RFP2 людини була відома, проте регуляторна область була секвенований до початку даної роботи, що і визначило постановку даної мети дослідження.

Таким чином, дана робота присвячена актуальній задачі вивчення і порівняльного аналізу регуляторних областей гена RFP2 у людини і миші. Робота проводилася в рамках планової тематики ІОГен РАН і підтримувалася грантами російських програм «Геном людини» і «РФФД».

Науково-практична значущість роботи

Однією з областей геному людини, імовірно беруть участь в супресії пухлинного фенотипу є область 13ql4.3. У складі цієї області виявлено кілька генів, які як передбачається, можуть виконувати функцію гена-супресора пухлинного росту. Одним з найбільш вірогідних генів-кандидатів в області 13ql4 є ген RFP2. Мутаційний аналіз білок-кодують ділянок цього гена не виявив соматичних мутацій у хворих на хронічний лімфолейкоз - тим не менш, саме в цій групі хворих втрата області генома 13ql4 є найбільш частою (до 80% в деяких вибірках). Однією з можливих мішеней для мутацій, инактивирующих ген, є його регуляторна область. Для проведення мутаційного аналізу цієї області у хворих необхідне знання її структури і принципів її регулювання в нормі. Структура промоторной області в разі гена RFP2 людини була невідома до початку даної роботи, хоча перша версія чорновий послідовності генома людини на той час вже була доступна. Крім того, структура регуляторноі області гена впливає на тканинний спектр його експресії. Тому інформація про структуру регуляторноі області пухлинних супресорів, необхідна для розуміння молекулярних механізмів виникнення і прогресії пухлин, асоційованих з втратою області 13ql4, в тому числі множинної мієломи і карциноми простати.

Принципи регуляції експресії генів у еукаріот Основні елементи

Промоторних ділянку є основним регуляторним районом гена, принципово важливим для його правильного функціонування. З цієї послідовності нуклеотидів за допомогою РНК-полімерази починається синтез РНК. У вищих еукаріот, в тому числі і у людини існують три РНК-полімерази: I, II і III. Кожна з них розпізнає свій набір промоторів і, тим самим, транскрибирует свій набір генів [Патрушев, 2000].

РНК-полімераза I транскрибирует рибосомальні гени (18S, 5.8S і 28S), представлені сотнями повторюваних копій, розділених спейсерами. Промотори РНК-полімерази I містять два базальних регуляторних елемента (CPE - core promoter element), локалізованих між положеннями - 75 і -50, а також -30 і +1. Послідовність СРЕ забезпечує специфічність транскрипції генів рРНК, і присутність її досить для ініціації.

Спейсери, що розділяють рибосомальні гени, відповідають за своїми властивостями промотор, однак, незважаючи на те, що в них вдається виявити мінімальні ділянки з промоторной активністю, на жаль вивести для них консенсусне послідовність виявилося поки неможливим. Треба сказати, що в кінці кожного спейсера знаходиться сайт термінації розміром 5 нуклеотидів, який відповідає також і за реініціації нового транскрипта. При вивільненні транскрипта полімераза I залишається пов'язаної з ДНК і, в результаті взаємодії з додатковим білковим фактором, тут же починає наступний акт ініціації транскрипції. Завдяки сполученню актів термінації і ініціації в одному сайті забезпечується висока ефективність процесу транскрипції, оскільки кожен новий акт ініціації не вимагає пошуку промотора. РНК-полімераза III транскрибирует три класи генів: гени 5S рРНК, тРНК і гени, що кодують малі ядерні РНК. Транскрипція цих генів не залежить від послідовностей, розташованих перед ними, а визначається промотором, який лежить всередині цих генів (Shenk Т., 1981). У разі генів тРНК, промотор складається з двох блоків, розділених відрізком ДНК довжиною близько 20 пар основ Перший блок починається через 8-30 п.н. після точки ініціації транскрипції і представлений відеконсенсусной послідовності TGGCNNAGTGG. Другий блок починається в позиціях (+51 - + 72) і має консенсус - GGTTCGANNCC. РНК полімераза II транскрибирует найбільший (понад 40 тисяч) і найрізноманітніший клас РНК - матричні РНК (мРНК), а також деякі малі РНК (міРНК). З трьох РНК полімерази полімераза II є найбільш доступною для регуляції. Промотори, впізнавані РНК полімеразою II надзвичайно різноманітні. Довжина їх варіюється від декількох сотень до декількох тисяч пар основ. Сама по собі РНК полімераза II не здатна до зв'язування з ДНК і ініціації транскрипції. По суті, все промотори РНК полімерази П є унікальними, так як включають в себе безліч різних комбінацій сайтів посадки регуляторних факторів. Регуляторні чинники зв'язуються з генами в районі, відповідному їх чинників. Енхансери, навпаки, можуть бути віддалені від старту транскрипції на велику відстань, до 60 тисяч пар основ, їх знаходять і в 5 -концевих і в З -концевих ділянках генів, енхансери можуть перекриватися як з екзонами, так і з интронами.

Якщо елементи базального промотора визначають точку початку транскрипції, то регуляторні проксимальні і інші елементи збільшують частоту (або ймовірність), з якої транскрипція ініціюється, а також визначають тканеспеціфіческіе спектр експресії транскрипта.

До недавнього часу було дуже мало відомо в цілому про альтернативних промоторах. У літературі було описано понад 200 альтернативних промоторів, що дозволяє уявити, як виглядає механізм цього явища.

Внесок альтернативних промоторів в різноманітність транскріптома оцінений з аналізу бази даних повнорозмірних клонів миші. В аналіз входило близько 21 тисячі повнорозмірних траскріптов, і по проведеним аналізом їх перших 5 альтернативних екзонів було виявлено близько 9% генів мають альтернативний промотор.

Подібна робота була зроблена і на транскріптоме людини. В комп'ютерний аналіз було взято 67 тисяч мРНК, кластеризуються в 18 тисяч локусів. Аналіз виявив, що близько 18% генів мали альтернативне зацькований.

Останнім часом були знайдені так звані двонаправлені промотори, здатні направляти транскрипцію генів, розташованих на двох різних колах ДНК. Звичайно, одночасна транскрипція з комплементарних ниток ДНК з одного і того ж ділянки за участю двох комплексів РНК-полімерази II неможлива внаслідок величезних розмірів транскрипционной машини.

Комплекси, що збираються на різних ланцюгах ДНК, можуть конкурувати між собою, або ж напрямок роботи промотора може бути тканеспеціфічним.

Порівняння регуляторних частин у гомологічних генів

Перші результати порівняння генома людини і чорнового варіанту геному миші показали, що в результаті такого підходу можна витягти дуже велика кількість інформації і значно полегшити процес пошуку генів. Порівняння 70 млн. Пар основ хромосоми 19 людини зі схожими послідовностями в геномі миші виявило 12000 консервативних елементів, в тому числі які раніше не виявлені Екзони, цілі гени, а також 4000 передбачуваних регуляторних елементів. Було також показано, що практично всі гени хромосоми 19 людини, що містяться в геномі у вигляді поодиноких копій, мають свої ортологи в геномі миші і, крім того, ортологічние гени подібно організовані в родинних геномах. У той же час, були знайдені і приклади значних структурних і регуляторних відмінностей між генами-Ортолог, в тому числі такі відмінності були показані для генів, що кодують фактори транскрипції з «цинковими пальцями», нюхові рецептори, рецептори феромонів, серинові протеази і ін. Помітно розрізняються гени часто організовані в кластери, нерідко містять тандемні повтори, відповідні окремим доменах або цільним генам в складі кластера. Завдяки присутності повторюваних ділянок кластери генів в процесі еволюції швидше накопичують хромосомні перебудови, в тому числі дуплікації і делеції, що призводить до появи великих структурних відмінностей, що виникають в процесі розбіжності еволюційних гілок, що ведуть до людини і до миші.

У грудні 2001 року були опубліковані перші дані порівняльного аналізу двох повних геномів ссавців - миші і людини. Незважаючи на те, що цитогенетичний аналіз дозволив зробити висновок про численні хромосомних перебудовах, що відбулися за цей час і що призвели до перетасуванням хромосомних фрагментів у складі геномів миші і людини, порівняльний аналіз цих геномів виявив 217 протяжних сінтенних хромосомних ділянок (блоків сінтеніі), що покривають 90, 2% геному людини і 93,3% генома миші. Різниця між двома останніми цифрами частково пояснюється різницею в довжині геномів -геном миші на 14% коротше генома людини. Ступінь консервативності сінтенних блоків помітно варіює від хромосоми до хромосомі. Так, хромосома X представлена \u200b\u200bодним блоком сінтеніі, людська хромосома 20 повністю відповідає частині мишачої хромосоми 2, причому для всіх частин хромосоми за винятком невеликого центрального сегмента збережений порядок проходження консервативних маркерів. Людська хромосома 17 також відповідає частині хромосоми 11 миші, однак в даному випадку велику кількість хромосомних перебудов призвело до утворення 16 окремих сегментів, що змінили своє розташування відносно один одного. З урахуванням інверсій і перестановок хромосомних фрагментів у складі блоків сінтеніі, ці блоки в багатьох випадках можна поділити на більш дрібні сінтенние ділянки (сегменти), загальним числом 342.

Цікаві спостереження були зроблені при порівняльному аналізі нуклеотидного складу двох геномів. Так, за загальним змістом нуклеотидів G і С в геномі людей і миша розрізняються несуттєво (41% нуклеотидів G і С в складі генома людини і 42% - в геномі миші). Однак, виявилося, що в геномі людини 1,4% «вікон» розміром 20 т.п.н. містять більше 56% нуклеотидів G і С, а 1,3% «вікон» - менше 33% G і С, в той час як в геномі миші «вікна» з таким екстремально високим і екстремально низьким вмістом зазначених нуклеотидів відсутні. Геном миші містить набагато менше CpG-острівців, ніж геном людини - 15500 проти 27000, що безпосередньо пов'язано з регулюванням.

Переваги порівняльної геноміки для виявлення регуляторних послідовностей неодноразово показувалися в різних теоретичних і експериментальних роботах Так було доведено, що еволюційно-консервативні послідовності, фланкирующие 1-й екзон гена ВТК, містять регуляторні елементи, які обумовлюють специфічну експресію цього гена.

Найбільш показовим прикладом є великомасштабний проект Genomatix (http://www.genomatix.de/), в якому були експериментально виявлені за допомогою мікрочіпів промоторні регіони всіх на даний момент відомих генів людини і миші. Велика частина цих промоторних регіонів (близько 6 тисяч) була виявлена \u200b\u200bза допомогою порівняльної генетики.

Транскрипційні фактор, який кодується геном Oct4, експресується в ембріональних стовбурових клітинах і статевих клітинах мишачих ембріонів, але відсутня в диференційованих соматичних клітинах. Зроблений аналіз промоторной послідовності гена Oct4 виявив область мінімального промотора, що не містить ТАТА-box, і два можливих енхансера - дистальний і проксимальний, але не дозволив однозначно судити про механізми регуляції специфічної експресії цього гена. Секвенування 5-області людського гомолога гена ОСТ4 і наступне порівняння відповідних послідовностей у людини і миші показало наявність в передбачуваних регуляторних послідовностях чотирьох консервативних ділянок (CR1-4) зі ступенем схожості 66% - 99%. При подальшому вивченні цих ділянок, які опинилися консервативними також і в геномі бика, в них були виявлені сайти впізнавання транскрипційних факторів Spl / Sp3 і елемент HRE (hormone responsive element).

Встановлення структури гена миші Щр2

Наступним етапом було з'ясування структури промотора і визначення механізмів регуляції гена Rfp2 миші. У разі подібності структури промоторів генів-Ортолог RFP2 у миші і людини, мишу можна було б використовувати як модельний організм для подальшого глибоко вивчення регуляції гена RFP2, тим більше що в результаті більш ранньої роботою виконаної в лабораторії аналізу генома ІОГен РАН було показано, що спектр тканеспеціфічності експресії гена RFP2 у людини і миші є подібним.

На момент початку роботи про структуру геному миші в області RFP2 нічого не було відомо. Мишачий гомолог Rfp2 розташований на 14-й хромосомі миші в області, сінтенной району 13ql4.3 людини. Раніше в нашій лабораторії на основі аналізу бази даних dbEST була встановлена \u200b\u200bin silico структура людського гомолога гена Rfp2 миші. В результаті були описані три ізоформи мРНК мишачого гена Rfp2 на основі перекриваються клонів кДНК АА499774, BF714458, ВВ575397, BG079221 і BF714459. Всі вони мають високу ступінь подібності з людським геном в кодує області. Комп'ютерний аналіз показав, що амінокислотні послідовності продуктів людського і мишачого генів мають однакову довжину і містять 86% ідентичних позицій і всього 8% нееквівалентний замін. У той же час, 5 -нетрансліруемие області мишачих изоформ складених in silico були гомологични людським послідовностям, наявними в базах даних GenBank і dbEST.

Першим етапом цієї частини роботи було експериментальне доказ існування виявлених in silico изоформ РНК мишачого ортолога гена Rfp2. Для цього ми провели ПНР на продуктах зворотною транскрипцією на тотальної РНК миші (ЗТ-ПЛР) на праймерів зазначених в таблиці 4.

Результати цього експерименту наведені на ріс.П. Отримані амліфікати були заклоніровани в вектор pGEMT-easy, і потім були визначені їх нуклеотидні послідовності. Таким чином, нам вдалося підтвердити існування двох ізоформ мРНК у цього гена -IF1 і IF2. Обидві ці ізоформи в своїй 5 нетрансльовані частини мають два альтернативних перших екзона і один загальний другий.

Наступним етапом було проведення комп'ютерного аналізу областей перед двома першими екзонами гена RFP2 миші. Аналіз нуклеотидних послідовностей показав середній вміст GC нуклеотидів в промоторной області - близько 60%. Нами було виявлено два регуляторних елемента перед екзонних 1а: ТАТА-бокс за 23 п.н. від точки ініціації транскрипції (CTTTTTATAGC) і GC-бокс за 158 п.н. (TGGGTGGCCC). У безпосередній близькості від другого екзона будь-яких регуляторних елементів виявлено не було. Аналіз щільності розподілу сайтів посадки транскрипційних факторів також не виявив дисбалансу між двома ланцюгами ДНК.

На момент початку роботи про структуру геному миші в області Rfp2 нічого не було відомо, вона з'явилася в ході даної роботи в 2002. Проведене нами порівняння генома людини і миші в області гена RFP2 показав, що в цьому районі проходить межа сінтеніі, розташована перед кодує екзонів. Таким чином, виявилося, що область промотора і перших двох екзонів гена RFP2 у людини і миші не має протяжних областей гомології.

У той же час важливо відзначити, що спектр тканеспеціфічності експресії цього гена у людини і миші залишається подібним. З цього випливало, що при порівнянні промоторних областей гена RFP2 у людини і миші можуть бути виявлені однакові регуляторні елементи.

Ми провели порівняльний аналіз особливостей промоторних областей гена RFP2 у миші і людини з метою виявлення загальних і різних регуляторних елементів:

Промоторних область гена RFP2 людини має дуже високий GC-складу - 72% в порівнянні з мишачим гомологом 60%. Також в промоторной області гена RFP2 людини локалізована область з повторами типу GnA, здатними утворювати такі складні вторинні структури як квадруплекси, які відіграють роль в регуляції транскрипції. 2) Регуляторні елементи Як вже було вище сказано, в промоторной області гена RFP2 людини не було виявлено ТАТА-боксу, але знайдено два GC-боксу. У мишачого гомолога перед екзонних ізоформи ГРІ були виявлені і ТАТА-бокс і GC-бокс. 3) Характер розподілу транскрипційних факторів у промоторной області У гена RFP2 людини виявлено дисбаланс щільності розподілу сайтів посадки транскрипційних факторів між комплементарними ланцюгами ДНК, і визначені сімейства факторів вносять основний вклад в цей розподіл - IKAROS, SP1, CETS1P54. У гена Rfp2 миші спостерігалося рівномірний розподіл щільності сайтів посадки транскрипційних факторів. 4) Альтернативний сплайсинг 5 -нетрансліруемих частин У гена RFP2 людини зареєстровано три ізоформи утворюються в результаті альтернативного сплайсингу перших двох нетрансльовані екзонів. Мишачий гомолог даного гена кодує дві ізоформи мРНК, IF1 і ГБ2, кожна з яких має свій промотор. 5) антисенс регуляція антисенс-транскрипт до гену RFP2 людини був клонований раніше в лабораторії аналізу генома ІОГен РАН. Для гомолога миші Rfp2 антисенс транскрипта виявлено не було. Як видно, ген RFP2 людини має дуже складну і абсолютно не схожу регуляцію в порівнянні з мишачим Ортолог. Використання миші як модельний організм для дослідження регуляції гена RFP2 не є обґрунтованим.

Зайцева, Юлія Володимирівна

1.1. Актуальність проблеми

1.2. Мета і завдання дослідження

1.3. Наукова новизна

1.4. Науково-практична значущість роботи

1.5. Обгрунтування постановки теми дисертаційної роботи

2. Огляд літератури

2.1. Принципи регуляції експресії генів у еукаріот.

Основні елементи

2.1.1. промотори

2.1.2. енхансери

2.1.3. транскрипційні фактори

2.1.4. Регуляція експресії генів за допомогою антисмислових РНК

2.2. Порівняння регуляторних частин у гомологічних генів

3. Матеріали та методи

3.1. Матеріали та обладнання

3.2. методи

4. Результати та обговорення

4.1. Визначення нуклеотидної послідовності промоторной області гена людини RFP

4.2. Комп'ютерний аналіз промоторной області гена людини RFP2.

4.3. Функціональна характеристика промоторної регіону гена людини RFP

4.4. Потенційні регуляторні елементи промоторной області гена людини RFP

4.5. Встановлення структури гена миші Rfp

4.6. Порівняльний аналіз області гена RFP2 у людини і

Введення дисертації (частина автореферату) на тему «Структура і особливості регуляції генів гомологів RFP2 у людини і миші»

1.1. Актуальність проблеми. Пухлинні захворювання є однією з провідних за частотою груп хвороб людини і однією з основних причин смертності дорослого населення. Імовірність виникнення і інтенсивність прогресії пухлин залежать від генотипу індивіда і від соматичних мутацій, що виникають в процесі індивідуального розвитку. Важливим генетичним бар'єром на шляху виникнення і прогресії пухлин є гени-супресори пухлин. Мутації в цих генах «запускають» пухлинний процес і етапи його прогресії. Вивчення тонкої структури і регуляції генів супресорів у людини необхідні для розуміння генетичного контролю норми, яка визначається цими генами, і молекулярно-генетичних механізмів виникнення і прогресії пухлин. Тому проведення таких досліджень є високо актуальним. Такі дослідження стали можливі в останні роки в результаті реалізації всесвітньої і російської програм геном людини. Дослідження тонкої структури і функціонування окремих областей геному проводять сьогодні шляхом зіставлення даних про структуру геному людини в нормі з даними про його структуру при патологічному пухлинному процесі, а також на основі даних порівняльної геноміки. Такий підхід став можливим лише в самий останній час, і бвл використаний в ході здійснення даної дисертаційної роботи. 1.2. Мета і завдання дослідження. Метою дослідження було вивчення структурнофункционального особливостей регуляторного району гена RFP2 людини, як найбільш ймовірного гена супрессора пухлинного росту, розташованого в області ql4 хромосоми 13. Для реалізації поставленої мети вирішувалися наступні завдання: 1. Визначити цього гена. 2. Провести біоінформатіческій аналіз промоторной області та виявити потенційні елементи регуляції транскрипції гена RFP2 3. Виявити і провести аналіз спектра потенційних і список сайтів самих зв'язування транскрипційних факторів нуклеотидную послідовність промоторної регіону гена RFP2 людини і точку ініціації транскрипції для транскрипційних факторів, взаємодіючих з регуляторної областю гена RFP2 у людини 4. Мінімізувати промоторних область гена RFP2 людини і експериментально елементи цього гена. 5. Визначити регіону гена порівняльний нуклеотидную RFP2 миші аналіз послідовність і провести послідовностей промоторної нуклеотидів біоінформатіческій локалізувати потенційні регуляторні промоторних районів гена RFP2 людини і миші і, таким чином, виявити причини подібності спектрів тканеспеціфічності експресії гена RFP2 у людини і миші. 1.3. Наукова новизна. Вперше визначена і зареєстрована в GenBank (AF363782) послідовність промоторних нуклеотидів гена довжиною 3,6 RFP2. т.п.н містить регіон людини Експериментально визначено положення точки ініціації транскрипції гена RFP2. Вперше проведено комп'ютерний аналіз промоторной області гена RFP2 людини і вьивлени потенційні елементи регуляції цього гена: GC-бокс і сайти зв'язування транскрипційних факторів. Виявлено унікальна особливість структури промотора гена RFP2: в транскрибируемой асиметрія в нитки ДНК перед ОС-боксом сайтів розташований зв'язування недосконалий повтор структури GnA довжиною 280 п.н. Виявлено розподілі кількості транскрипційних факторів в області недосконалого повтору: близько 200 сайтів знаходяться в транскрибируемой нитки ДНК, а в нитки, комплементарної цій ділянці, сайти зв'язування відсутні. Вперше за допомогою люціферазних конструкцій локалізовані чотири регуляторних елемента промотора гена RFP2: базальний промотор, енхансер, сайленсери і ділянку, що відповідає за стабільність мРНК гена RFP2. Визначено потенційні сайти промотора зв'язування гена RFP2, транскрипційних факторів у ділянках імовірно містять енхансер і сайленсери. Проведено порівняльний комп'ютерний аналіз послідовності нуклеотидів промоторной області гена RFP2 людини і миші. Виявлено розрив сінтеніі хромосом людини і миші безпосередньо перед белоккодірующей областю гена, яка залишається гомологичной у людини і миші. Експериментально виявлено дві ізоформи гена миші ортологічного гену RFP2 людини. Вперше за допомогою біоінформатіческого аналізу в регуляторній частині гена RFP2 у миші виявлено набір 20 потенційних сайтів зв'язування для 18 факторів транскрипції, що відносяться до 11 родин. Проведено порівняльний аналіз наборів сайтів зв'язування транскрипційних факторів і самих транскрипційних факторів у регуляторній області генів RFP2 у миші і людини.

Схожі дисертаційні роботи за фахом «Генетика», 03.00.15 шифр ВАК

Структура і функціонування 5 "-регуляторной області гена NANOG східно-європейської полівки 2013 рік, кандидат біологічних наук Сорокін, Михайло Олексійович
Механізми регуляції довжини теломер і дистанційних регуляторних взаємодій у Drosophila melanogaster 2013 рік, доктор біологічних наук Мельникова, Лариса Сергіївна
Функціональний аналіз структурних елементів промотора гена udp Escherichia coli 2003 рік, кандидат біологічних наук Овчарова, Ірина Вікторівна
Структурно-функціональна організація промоторной області міжгенних спейсера генів p РНК у диплоїдних пшениць 1999 рік, кандидат біологічних наук Ахунов, Едуард Діргатовіч
Регуляторні райони контрольованих глюкокортикоїдами генів: Експериментальне та теоретичне дослідження 2002 рік, доктор біологічних наук Меркулова, Тетяна Іванівна

висновок дисертації по темі «Генетика», Скоблов, Михайло Юрійович

1. Визначено та зареєстрована в GenBank (AF363782) послідовність нуклеотидів довжиною 3,6 т.п.н містить промоторних регіону і ділянку ініціації транскрипції гена RFP2 людини. Положення точки ініціації транскрипції гена RFP2 визначено експериментально.

2. Проведено комп'ютерний аналіз промоторной області гена RFP2 людини і виявлені потенційні елементи регуляції цього гена: GC-бокс і сайти зв'язування транскрипційних факторів. Проведений аналіз виявив близько 300 потенційних сайтів зв'язування, для 26 факторів транскрипції, що відносяться до 17 родин.

3. Виявлено унікальна особливість структури промотора гена RFP2 людини: в транскрибируемой ланцюга ДНК перед GC-боксом розташований недосконалий повтор структури GnA довжиною 280 п.н. Виявлено асиметрія в розподілі кількості сайтів зв'язування транскрипційних факторів в області недосконалого повтору: близько 200 сайтів знаходяться в транскрибируемой ланцюга ДНК, а в ланцюзі, комплементарної цій ділянці, сайти зв'язування відсутні.

4. Отримано 9 делеционного похідних промоторної ділянки гена RFP2 людини в складі рекомбінантних плазмід з репортерного геном люциферази. Експериментально визначено активність промотора кожного делеционного варіанти і локалізовані чотири регуляторних елемента промотора гена RFP2: базальний промотор, енхансер, сайленсери і ділянку, що відповідає за стабільність РНК гена RFP2.

5. Визначено потенційні сайти зв'язування транскрипційних факторів у ділянках промотора гена RFP2 людини, імовірно містять енхансер і сайленсери.

6. Експериментально виявлено дві ізоформи гена миші ортологічного гену RFP2 людини визначивши тим самим можливі промоторні регіони. Проведено порівняльний комп'ютерний аналіз послідовності нуклеотидів промоторной області гена RFP2 людини встановленої в нашій роботі і опублікованій в ході нашої роботи послідовності нуклеотидів промоторной області гена Rfp2 миші. Виявлено розрив сінтеніі хромосом людини і миші безпосередньо перед білок-кодує областю гена, яка залишається гомологичной у людини і миші.

7. Проведено біоінформатіческій аналіз регуляторної частини гена Rfp2 у миші. Проведено порівняльний аналіз регуляторних елементів виявлених в промоторних областях генів RFP2 у миші і людини. Проаналізовані регуляторні елементи транскрипції не мають спільних рис для пояснення схожості спектрів тканеспеціфічності експресії гена RFP2 у людини і миші.

Список літератури дисертаційного дослідження кандидат біологічних наук Скоблов, Михайло Юрійович, 2004 рік

1. Патрушев Л.І., Експресія генів., Москва, 2000.

2. Abbott A., Abu-Threideh J., Ahrens С., et al. Genome Sequence of the Nematode Caenorhabditis elegans. A Platform for Investigating Biology // Science. 1998. V. 282. P. 2012-2018.

3. Adams MD, Celniker SE, Holt RA., Et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster // Science. 2000. V. 287. P. 2185-95.

4. Aravin AA., Naumova NM, Tulin AV, Vagin VV, Rozovsky YM, Gvozdev VA. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline.// Curr. Biol. 2001. V. 11, P. 1017-1027.

5. Banerji J., Olson L., Schaffher W. A lymphocyte-specific cellular enhancer is located downstream of the joining region in immunoglobulin heavy chain genes // Cell. 1983. V. 33, P. 729-740.

6. Baranova AV, Lobashev AV, Ivanov DV, Krukovskaya LL, Yankovsky NK, Kozlov AP. In silico screening for tumour-specific expressed sequences in human genome. // FEBS Lett. 2001. V. 508 P. 143-8.

7. Bass BL. RNA editing by adenosine deaminases that act on RNA. // Annu. Rev. Biochem. 2002. V. 71, P. 817-846.

8. Baylin SB, Herman JG. Epigenetics and loss of gene function in cancer. In DNA Alterations in Cancer (Ehrlich, M., ed.). Eaton publishing, MA, USA. 2000. P. 293-309.

9. Blackwood EM, Kadonaga JT. Going the Distance: A Current View of Enhancer Action. // Science., 1998., V. 281. P.60.

10. Blackwood MA, Weber BL. BRCA1 and BRCA2: from molecular genetics to clinical medicine. // J Clin Oncol. 1998. V. 16. P. 1969-77.

11. Burke LJ, Zhang R, Lutz M, Renkawitz R. The thyroid hormone receptor and the insulator protein CTCF: two different factors with overlapping functions. // J Steroid Biochem Mol Biol. 2002. V. 83. P. 49-57.

12. Castresana J. Genes on human chromosome 19 show extreme divergence from the mouse orthologs and a high GC content // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P.1751 1 757.

13. Chinwalla AT, Cook LL, Delehaunty KD, et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome // Nature. 2002. V. 420. P. 520-562.

14. Ehrlich M. DNA hypomethylation and cancer. // In: DNA Alterations in Cancer. (Ehrlich, M., ed.). Eaton Publishing, MA, USA. 2000. P. 273-291.

15. Emes RD, Goodstadt L, Winter EE, Ponting CP. Comparison of the genomes of human and mouse lays the foundation of genome zoology. // Hum Mol Genet. 2003 Apr 1; 12 (7): 701-9.

16. Feng Q., Zhang Y., Hao P., et al. Sequence and analysis of rice chromosome 4 // Nature. 2002. V. 420. P. 316-20.

17. Gibbs RA, Weinstock GM, Metzker ML, Muzny DM, Sodergren EJ, Scherer S, Scott G. Genome sequence of the Brown Norway rat yields insights into mammalian evolution. // Nature. 2004. V. 428. P. 493-521.

18. Gilles SD, Tonegawa S., Expression of cloned immunoglobulin genes introduced into mouse L cells. // Nucleic Acids Res. 1983. V. 11. P. 7981-97.

19. Goffeau A., Barrell B.G., Bussey H., et al. Life with 6000 genes // Science. 1996. V. 274. P. 563-7.

20. Gray M.D., Shen J.C., Kamath-Loel A.S. et al. The Werner syndrome protein is a DNA helicase. // Nature Genet. 1997. V. 17. P. 100103.

21. Grosschedl R, Birnstiel M. Spacer DNA sequences upstream of the TATA sequence are essential for promotion of H2a gene transcription in vivo. // Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 1980. V. 77, P. 7102 7106.

22. Ham J, Steger G, Yaniv M., How do eukaryotic activator proteins stimulate the rate of transcription by RNA polymerase II? // FEBS Lett. 1992. V. 307. P. 81-6.

23. Hannon, G.J. RNA interference. // Nature. 2002. V. 418, 244-251

24. Holt RA., Subramanian GM, Halpern A, et al. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae // Science. 2002. V. 298. P. 129-49.

25. Kennerdell JR, Yamaguchi S, Carthew RW. RNAi is activated during Drosophila oocyte maturation in a manner dependent on aubergine and spindle-E. // Genes Dev. 2002 V. 16, P. 1884-1889.

26. Kim J, Iyer VR., Global role of TATA box-binding protein recruitment to promoters in mediating gene expression profiles. // Mol Cell Biol. 2004. V. 24. P. 8104-12.

27. Kiyosawa H, Yamanaka I, Osato N, Kondo S, Hayashizaki Y; RIKEN GER Group; GSL Members. .Antisense transcripts with FANTOM2 clone set and their implications for gene regulation. // Genome Res. 2002. V. 13, P. 1324-1334.

28. Koop B.F., Hood L. Striking sequence similarity over almost 100 kilobases of human and mouse T-cell receptor DNA // Nat Genet. 1994. V. 7. P. 48-53.

29. Kumar M. and Carmichael GG. Nuclear antisense RNA induces extensive adenosine modifications and nuclear retention of target transcripts. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. V. 94, P. 3542-3547.

30. Kuo S, Chesrown SE, Mellott JK, Rogers RJ, Hsu JL, Nick HS. In vivo architecture of the manganese superoxide dismutase promoter. II J Biol Chem. 1999. V. 274 P.3345-54.

31. Lamerdin JE, Montgomery MA, Stilwagen S.A., Scheidecker LK, Tebbs RS, Brookman KW, Thompson LH, Carrano AV. Genomic sequence comparison of the human and mouse XRCC1 DNA repair gene regions. // Genomics. 1995. V. 25. P. 547-54.

32. Lander E.S., Linton L.M., Birren В., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome // Nature. 2001. V. 409. P. 860-921.

33. Lavorgna G., Dahary D, Lehner B, Sorek R, Sanderson C.M., Casari G. In search of antisense. // Trends in Biochemical Sciences 2004. V.29.P. 15-21.

34. Lehner, B. et al. Antisense transcripts in the human genome. // Trends Genet. 2002. V. 18, P. 63-65.

35. Lieberman PM, Berk AJ. A mechanism for TAFs in transcriptional activation: activation domain enhancement of TFIID-TFIIA - promoter DNA complex formation. // Genes Dev. 1994 V.8. P.995-1006.

36. Magoulas C, Fried M. Isolation and genomic analysis of the human surf-6 gene: a member of the Surfeit locus // Gene. 2000. Vol. 8. P. 115-23.

37. Munroe, SH, Lazar MA. Inhibition of c-erbA mRNA splicing by a naturally occurring antisense RNA. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 2208322086.

38. Nordhoff V., Hubner K., Bauer A., \u200b\u200bet al. Comparative analysis of human, bovine, and murine Oct-4 upstream promoter sequences // Mamm Genome. 2001. Vol. 12. P. 309-17.

39. Oeltjen J., Malley Т., Muzny D., et al. Large-scale comparative sequence analysis of the human and murine bruton "s tyrosine kinase loci reveals conserved regulatory domains // Genome Research. 1997. V. 7. P. 315-329.

40. Okazaki Y., M. Furuno, T. Kasukawa, J. Adachi, H. Bono, S. Kondo, et al., Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. // Nature., 2002 V. 420, P. 563-73.

41. Pedersen AG, Baldi P, Chauvin Y, Brunak S., The biology of eukaryotic promoter prediction-a review. // Comput Chem. 1999. V. 23. P. 191-207.

42. Peters, NT, Rohrbach JA, Zalewski BA, Byrkett CM, Vaughn JC. RNA editing and regulation of Drosophila 4frnp expression by sas-10 antisense readthrough mRNA transcripts. // RNA. 2002. V. 9. P. 698-710.

43. Prescott EM. Proudfoot NJ. Transcriptional collision between convergent genes in budding yeast. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. V. 99. P. 8796-8801.

44. Ptashne M. How eukaryotic transcriptional activators work. II Nature. 1988. V.335. P. 683-9.

45. Ptashne M, Gann AA. Activators and targets. // Nature. 1990. V. 346. P. 329-31.

46. \u200b\u200bQueen C, Baltimore D. Immunoglobulin gene transcription is activated by downstream sequence elements. // Cell. 1983. V. 33. P. 741-8.

47. Reik W, Walter, J. Genomic imprinting: parental influence on the genome. // Nat. Rev. Genet. 2001. V. 2. P. 21-32.

48. Risitano A, Fox KR. Stability of intramolecular DNA quadruplexes: comparison with DNA duplexes. // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 6507-13.

49. Runte M, Huttenhofer A, Gross S, Kiefmann M, Horsthemke B, Buiting K. The IC-SNURF-SNRPN transcript serves as a host for multiple small nucleolar RNA species and as an antisense RNA for UBE3A. // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. P. 2687-2700.

50. Salanoubat M., Lemcke K., Rieger M., et al. Sequence and analysis of chromosome 3 of the plant Arabidopsis thaliana. // Nature. 2000. V. 408. P. 820-2.

51. Sanchez M., Queralt R., Bruguera M., Rodes J., Oliva R. Cloning, sequencing and characterization of the rat hereditary hemochromatosis promoter: comparison of the human, mouse and rat HFE promoter regions // Gene. 1998. Vol. 225. P. 77-87.

52. Sasaki Т., Matsumoto Т., Yamamoto K., et al. The genome sequence and structure of rice chromosome 1 // Nature. 2002. V. 420. P. 3126.

53. Scadden AD, Smith CW. Specific cleavage of hyper-edited dsRNAs. // EMBO J. 2001. V. 20. P. 4243-4252.

54. Schild-Poulter C, Shih A, Yarymowich NC, Hache RJ. Down-regulation of histone H2B by DNA-dependent protein kinase in response to DNA damage through modulation of octamer transcription factor 1. // Cancer Res. 2003. V. 63. P. 7197-205.

55. Schramke V, Allshire, R. Hairpin RNAs and retrotransposon LTRs affect RNAi and chromatin-based gene silencing. // Science. 2003. V. 301. P. 1069-1074.

56. Shendure J, Church G.M. Computational discovery of sense-antisense transcription in the human and mouse genomes. // Genome Biol. 2002 V.3. P.l-14.

57. Shenk T. Transcriptional control regions: nucleotide sequence requirements for initiation by RNA polymerase II and Ш. // Curr Top Microbiol Immunol. 1981. V. 93 P. 25-46.

58. Sorek R, Safer, HM. A novel algorithm for computational identification of contaminated EST libraries. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 1067-1074.

59. Stamm S, Zhu J, Nakai K, Stoilov P, Stoss O, Zhang M. An alternative-exon database and its statistical analysis. // DNA Cell Biol. 2002. V. 19. P. 739-756.

60. Suzuki Y, Yamashita R, Shirota M, Sakakibara Y, Chiba J, Mizushima-Sugano J, Nakai K, Sugano S. Sequence comparison of human and mouse genes reveals a homologous block structure in the promoter regions. // Genome Res. 2004. V. 14. P. 1711-8.

61. Tabata S., Kaneko Т., Nakamura Y., et al. Sequence and analysis of chromosome 5 of the plant Arabidopsis thaliana. // Nature. 2000. V. 408. P. 823-6.

62. The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana // Nature. 2000. V. 408. P. 796-815.

63. Theologis A, Ecker JR, Palm CJ et al. Sequence and analysis of chromosome 1 of the plant Arabidopsis thaliana // Nature. 2000. V.408. P. 816-20.

64. Tufarelli C., Stanley JA, Garrick D, Shaipe JA, Ayyub H, Wood WG, Higgs DR. Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease. // Nat. Genet. 2003. V. 34. P. 157-165.

65. Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W., et. al. The sequence of the human genome // Science. 2001. V. 291. P. 1304-1351.

66. Volpe ТА, Kidner C, Hall IM, Teng G, Grewal SI, Martienssen RA. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science. 2002. V. 297 P. 1833-1837.

67. Weaks RL, Ramsoondar JJ, Gallagher DS Jr, Nogues C, Piedrahita JA. Isolation, characterization and chromosomal localization of the porcineciliary neurotrophic factor (CNTF) gene 11 Anim Genet. 1997. Vol. 28. P. 354-7.

68. Westman В J, Mackay JP, Gell D. Ikaros: a key regulator of haematopoiesis. // Int J Biochem Cell Biol. 2002. V. 34. P. 1304-7.

69. Wingender E, Dietze P, Karas H, Knuppel R. TRANSFAC: a database on transcription factors and their DNA binding sites. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 238-41.

70. Wutz A. Barlow DP. Imprinted expression of the Igf2r gene depends on an intronic CpG island. // Mol Cell Endocrinol. 1998. V.140, 914.

71. Zhang Z, Carmichael GG. The fate of dsRNA in the in the human genome. // Nat. Biotechnol. 2001. V. 21. P. 379-386.

72. Zhu H, Joliot V, Prywes R., Role of transcription factor TFIIF in serum response factor-activated transcription // J Biol Chem. 1994. V. 269. P.3489-97.

74. Іванов Д.В., Бородіна Т.А., Скоблов М.Ю., Пестова А.А., Капанадзе Б.І., Сангфельдт У., Ейнхорна С., Баранова О.В., Янковський Н.К .

75. Структурний і функціональний дослідження нового гена людини RFP2. Постерні повідомлення на 10-й підсумковій конф. "Геном Людини-2000", г.Черноголовка, 18-22 грудня 2000 р

76. M.Yu. Skoblov, D.V. Ivanov, K.S.Shachbasov, A.V.Baranova, N.K.Yankovsky Promoter region structure of human gene RFP2 Molecular mechanisms of genetic processes and biotechnology International symposium, 2001., Novemberl 8-24, Moscow-Minsk

77. Я дякую всім людей, які допомогли мені виконати цю роботу, а також тих, хто мені в цьому не заважав:

78. Миколи Казимировича Янковського за наукове і адміністративне керівництво, і існування чудової лабораторії аналізу генома.

79. Анчу Баранову за те, що завдяки їй склалося моє науковий світогляд, і я відчув свободу наукової діяльності. Спасибі за все, за цю маленьку життя, яке ми прожили.

80. Аню Гуськову і Костю Шахбазова йти вперед, в невідомість, найважче. Спасибі, що ви були зі мною.

81. Спасибі Андрію Лобашева за його спілкування, спогад про який мені дуже приємні.

82. Всіх співробітників, аспірантів і студентів лабораторії аналізу генома, колишніх і нинішніх, за приємну людську атмосферу.

83. Моїх батьків, за їх постійну підтримку і розуміння.

Зверніть увагу, представлені вище наукові тексти розміщені для ознайомлення і отримані за допомогою розпізнавання оригінальних текстів дисертацій (OCR). У зв'язку з чим, в них можуть міститися помилки, пов'язані з недосконалістю алгоритмів розпізнавання. У PDF файлах дисертацій і авторефератів, які ми доставляємо, подібних помилок немає.

Щоб звузити результати пошукової видачі, можна уточнити запит, вказавши поля, за якими здійснювати пошук. Список полів представлений вище. наприклад:

Можна шукати по декількох полях одночасно:

логічно оператори

За замовчуванням використовується оператор AND.
оператор AND означає, що документ повинен відповідати всім елементам в групі:

дослідження розробка

оператор OR означає, що документ повинен відповідати одному з значень в групі:

дослідження OR розробка

оператор NOT виключає документи, що містять цей елемент:

дослідження NOT розробка

Тип пошуку

При написанні запиту можна вказувати спосіб, за яким фраза буде шукатися. Підтримується чотири методи: пошук з урахуванням морфології, без морфології, пошук префікса, пошук фрази.
За замовчуванням, пошук проводиться з урахуванням морфології.
Для пошуку без морфології, перед словами у фразі досить поставити знак "долар":

$ дослідження $ розвитку

Для пошуку префікса потрібно поставити зірочку після запиту:

дослідження *

Для пошуку фрази потрібно укласти запит в подвійні лапки:

" дослідження і розробка "

Пошук по синонімів

Для зарахування до результатів пошуку синонімів слова потрібно поставити грати " # "Перед словом або перед виразом в дужках.
У застосуванні до одного слова для нього буде знайдено до трьох синонімів.
У застосуванні до вираження в дужках до кожного слова буде додано синонім, якщо він був знайдений.
Чи не поєднується з пошуком без морфології, пошуком по префіксу або пошуком по фразі.

# дослідження

угруповання

Для того, щоб згрупувати пошукові фрази потрібно використовувати дужки. Це дозволяє управляти булевої логікою запиту.
Наприклад, потрібно скласти запит: знайти документи у яких автор Іванов або Петров, і назву містить слова дослідження або розробка:

Приблизний пошук слова

Для приблизного пошуку потрібно поставити тильду " ~ "В кінці слова з фрази. Наприклад:

бром ~

При пошуку будуть знайдені такі слова, як "бром", "ром", "пром" і т.д.
Можна додатково вказати максимальна кількість можливих правок: 0, 1 або 2. Наприклад:

бром ~1

За замовчуванням допускається 2 правки.

критерій близькості

Для пошуку за критерієм близькості, потрібно поставити тильду " ~ "В кінці фрази. Наприклад, для того, щоб знайти документи зі словами дослідження і розробка в межах 2 слів, використовуйте наступний запит:

" дослідження розробка "~2

релевантність виразів

Для зміни релевантності окремих виразів в пошуку використовуйте знак " ^ "В кінці виразу, після чого вкажіть рівень релевантності цього виразу по відношенню до решти.
Чим вище рівень, тим більше релевантне цей вислів.
Наприклад, в даному виразі слово "дослідження" в чотири рази релевантні слова "розробка":

дослідження ^4 розробка

За замовчуванням, рівень дорівнює 1. Допустимі значення - позитивне дійсне число.

Пошук в інтервалі

Для вказівки інтервалу, в якому повинно знаходитися значення якогось поля, слід вказати в дужках граничні значення, розділені оператором TO.
Буде проведена лексикографічна сортування.

Такий запит поверне результати з автором, починаючи від Іванова і закінчуючи Петровим, але Іванов і Петров не будуть включені в результат.
Для того, щоб включити значення в інтервал, використовуйте квадратні дужки. Для виключення значення використовуйте фігурні дужки.

Схожі статті

Як правильно Каспійське море або озеро?

Каспійське море - найбільше на Землі озеро, безстічне, розташоване на стику Європи і Азії, зване морем через свої розміри, а також через те, що його ложе складено земною корою океанічного типу. Вода в Каспії солона, -...
Село Оймякон - самий холодний населений пункт в світі

Оймякон найбільш відомий як один з «Полюсов холоду» на планеті, по ряду параметрів Оймяконском долина - найбільш суворе місце на Землі, де проживає постійне населення. Географія Оймякон знаходиться в приполярних широтах, проте ...
Оттава, Канада - фото Оттави, пам'ятки, карта, погода, відгуки туристів Переважаючі вітри в Оттаві взимку і влітку

Оттава (Ottawa) - столиця і четвертий за величиною місто Канади. Це розвинений політичний і технологічний центр країни. Головною особливістю канадської столиці є чистота, високий рівень життя, просторі і доглянуті вулиці, ...
Визначення 1 ньютона. Біографія ньютона. Що таке ньютон: одиниця виміру або фізична величина

Конвертер довжини і відстані конвертер маси конвертер заходів обсягу сипучих продуктів і продуктів харчування конвертер площі конвертер обсягу і одиниць вимірювання в кулінарних рецептах конвертер температури конвертер тиску, механічного ...
Схід і захід сонця Захід сонця 23 вересня

На питання час сходу і заходу 23 вересня заданий автором Колосові краща відповідь це Спостерігаючи за добовим рухом Сонця протягом року, можна легко помітити в його русі ряд особливостей, що відрізняються від добового руху зірок ....
Черкаське (Новомосковський район) Об'єкти соціальної сфери

Є адміністративним центром Черкаського селищної ради, до якого не входять інші населені пункти. Географічне положення Селище міського типу Черкаське знаходиться на лівому березі річки Самара, вище за течією на ...

Науково-практична значущість роботи

Принципи регуляції експресії генів у еукаріот Основні елементи

Порівняння регуляторних частин у гомологічних генів

Встановлення структури гена миші Щр2

Рекомендований список дисертацій

Транскрипційні регуляція кластерів семенник-специфічних генів Stellate y Drosophila melanogaster 2015 рік, кандидат біологічних наук Оленкіна, Оксана Михайлівна

Визначення та аналіз регуляторних районів гена XIST полівки Microtus Rossiaemeridionalis 2011 рік, кандидат біологічних наук Орищенко, Костянтин Євгенович

Картування регуляторних послідовностей в складі ретротранспозонов HERV-K (HML-2) і L1 2013 рік, кандидат біологічних наук Александрова, Олена Олександрівна

Введення дисертації (частина автореферату) на тему «Структура і особливості регуляції генів гомологів RFP2 у людини і миші»

Схожі дисертаційні роботи за фахом «Генетика», 03.00.15 шифр ВАК

Структура і функціонування 5 "-регуляторной області гена NANOG східно-європейської полівки 2013 рік, кандидат біологічних наук Сорокін, Михайло Олексійович

Механізми регуляції довжини теломер і дистанційних регуляторних взаємодій у Drosophila melanogaster 2013 рік, доктор біологічних наук Мельникова, Лариса Сергіївна

Функціональний аналіз структурних елементів промотора гена udp Escherichia coli 2003 рік, кандидат біологічних наук Овчарова, Ірина Вікторівна

висновок дисертації по темі «Генетика», Скоблов, Михайло Юрійович

Список літератури дисертаційного дослідження кандидат біологічних наук Скоблов, Михайло Юрійович, 2004 рік

логічно оператори

Тип пошуку

Пошук по синонімів

угруповання

Приблизний пошук слова

критерій близькості

релевантність виразів

Пошук в інтервалі

Схожі статті

Як правильно Каспійське море або озеро?

Село Оймякон - самий холодний населений пункт в світі

Оттава, Канада - фото Оттави, пам'ятки, карта, погода, відгуки туристів Переважаючі вітри в Оттаві взимку і влітку

Визначення 1 ньютона. Біографія ньютона. Що таке ньютон: одиниця виміру або фізична величина

Схід і захід сонця Захід сонця 23 вересня

Черкаське (Новомосковський район) Об'єкти соціальної сфери

Підпишіться на новини