Пептидний зв'язок має властивості частково подвійного зв'язку. Це проявляється в зменшенні довжини зв'язку з цим (0,132 нм) в порівнянні з довжиною простий зв'язку C N (0,147 нм). Частково двоесвязний характер пептидного зв'язку унеможливлює вільне обертання заступників навколо неї, тому пептидная угруповання є плоскою і має зазвичай транс-конфігурацію (ф-ла I). Tаким чином, остов пептидного ланцюга є ряд жорстких площин з рухомим ( "шарнірним") зчленуванням в місці, де розташовані асиметричні атоми С (в ф-ле I позначені зірочкою).

У розчинах пептидів спостерігається переважне утворення певних конформеров. З подовженням ланцюга більш виражену стійкість набувають (аналогічно білкам) впорядковані елементи вторинної структури. Освіта вторинної структури особливо характерно для регулярних пептидів, зокрема для полиаминокислот.

властивості

Олігопептиди за властивостями близькі до амінокислотам, поліпептиди подібні до білків. Олігопептиди представляють собою, як правило, кристалічні речовини, Що розкладаються при нагріванні до 200 300 0 C. Вони добре розчиняються у воді, розбавлених кислотах і лугах, майже не розчинні в органічних розчинниках. Винятки становлять олігопептиди, побудовані із залишків гідрофобних амінокислот.

Олігопептиди володіють амфотерними властивостями і, в залежності від кислотності середовища, можуть існувати у формі катіонів, аніонів або цвіттер-іонів. Основні смуги поглинання в ІЧ спектрі для групи NH 3300 і 3080 см -1, для групи C = O 1660 см -1. В УФ спектрі смуга поглинання пептидного групи знаходиться в області 180-230 нм. Ізоелектрична точка (РІ) пептидів коливається в широких межах і залежить від складу амінокислотних залишків в молекулі. Величини рК а пептидів становлять для а-СООН ок. 3, для -H 2 ок. 8.

Хімічні властивості олигопептидов визначаються містяться в них функціональними групами, а також особливостями пептидного зв'язку. Їх хімічні перетворення в значній мірі аналогічні відповідним реакцій амінокислот. Вони дають позитивну біуретову реакцію і Нінгідринова реакцію. Дипептиди і їх похідні (особливо ефіри) легко циклизующихся, перетворюючись в дікетопіперазін. Під дією 5,7 нормальної соляної кислоти пептиди гідролізуються до амінокислот протягом 24год при 105 0 C.

синтез пептидів

У пептидному синтезі використовуються відомі з органічної хімії реакції отримання амідів і спеціально розроблені методи для синтезу пептидів. Для успішного здійснення цих синтезів необхідно активувати карбоксильну групу, тобто збільшити електрофільне карбонильного вуглецю. Це досягається шляхом хімічної модифікації карбоксильної групи амінокислот. Тип такої модифікації зазвичай визначає назву методу пептидного синтезу.

1. Хлорангідрідний метод.

В основі методу лежить реакція отримання амідів взаємодією хлорангидридов кислот з відповідними амінами. Саме цим способом були отримані перші пептиди. В даний час цей метод застосовується вкрай рідко, оскільки він супроводжується утворенням побічних продуктів і рацемізації пептидів.

2. Азідний метод

Вихідною речовиною в даному способі найчастіше є етиловий ефір N-захищеної амінокислоти, з якої отримують гідразид, останній перетворюють за допомогою нітриту натрію в присутності соляної кислоти в азид кислоти. В реакції зазвичай застосовують гідразин, у якого один з азоту заблокований захисної групою (Z-карбобензоксі- або карботретбутілоксігруппа), що дозволяє уникнути утворення побічних дігідразідов. Азиди при взаємодії з С-захищеними амінокислотами в м'яких умовах утворюють пептиди.

Рацемізації в цьому методі зведена до мінімуму, проте можуть протікати побічні реакції, а саме: азиди можуть перегруповуватися в ізоцианати, які в свою чергу при взаємодії зі спиртом, використовуваним в якості розчинника, утворюють уретани.

3. Змішані ангідриди

Широке застосування в пептидному синтезі знайшли змішані ангідриди амінокислот з похідними вугільної кислоти, Одержувані, наприклад, за допомогою ізобутілхлоркарбоната:

Реакцію в цьому синтезі проводять при низькій температурі (-10 ..- 20 С), досить швидко, що значно знижує можливість утворення побічних продуктів і рацемизации. Швидкий ступінчастий синтез пептидів з використанням змішаних ангідридів носить назву REMA-синтез. Методи освіти з використанням змішаних ангідридів широко застосовуються в твердофазном синтезі пептидів.

Таким чином, проведення пептидного синтезу вимагає обліку і жорсткого дотримання деяких факторів. Так, з метою зниження утворення побічних продуктів і рацемизации, рекомендуються такі типові умови проведення реакції утворення пептидного зв'язку:

1) процес необхідно проводити при низьких температурах, час реакції має бути мінімальним;

2) реакційна маса повинна мати рН, близьку до нейтральної;

3) в якості кіслотосвязивающіх реагентів використовують органічні підстави, як піперидин, морфолін тощо;

4) проведення реакції бажано в безводних середовищах.

твердофазний синтез

Твердофазний синтез - методичний підхід до синтезу олігомерів (полімерів) з використанням твердого нерозчинного носія, Що представляє собою органічний або неорганічний полімер.

На початку 60-х років був запропонований новий підхід до вирішення проблем виділення і очищення, що виникають в пептидному синтезі. Пізніше автор відкриття цього підходу, Р.Б. Мерріфілд, в своїй Нобелівській лекції розповів, як це сталося: "Одного разу у мене виникла думка про те, як може бути досягнута мета більш ефективного синтезу пептидів. План полягав у тому, щоб збирати пептидную ланцюг постадійно, причому під час синтезу ланцюг повинна бути одним кінцем прив'язана до твердого носія ". В результаті виділення і очищення проміжних і цільових похідних пептидів зводилися просто до фільтрування і ретельної промивки твердого полімеру для видалення всіх надлишкових реагентів і побічних продуктів, що залишаються в розчині. Така механічна операція може бути виконана кількісно, ​​легко стандартизується і може бути навіть автоматизована. Розглянемо цю процедуру більш докладно.

«Біолог. журн. Вірменії, 1 (65), 2013 твердофазна СИНТЕЗ КАРДІОАКТІВНОГО пептиду, виділеного з ПЕРЕДСЕРДЬ СВИНІ Г.С. ЧАІЛЯН Інститут біохімії ім. Бунятян НАН РА ... »

Експериментальні та теоретичні статті

Experimental and theoretical articles

Біолог. журн. Вірменії, 1 (65), 2013

Твердофазна СИНТЕЗ КАРДІОАКТІВНОГО пептидів,

ВИДІЛЕНОГО З ПЕРЕДСЕРДЬ СВИНІ

Г.С. ЧАІЛЯН

Інститут біохімії ім. Бунятян НАН РА

[Email protected]

З метою продовження досліджень акад. Галоян, нами було проведено ряд експериментів по виділенню, очищення та визначенню біологічної спрямованості нововиделенних з'єднань пептидної природи з передсердь і Ушкова частин серця свині. Для проведення биотестов потрібно отримати препаративні кількості досліджуваних зразків. Для цього ми скористалися методикою твердофазного синтезу пептидів з її подальшою модифікацією. Чистота та ідентичність синтезованих препаратів перевірялися методами високоефективної рідинної хроматографії і мас-спектрального аналізу.

Твердофазний синтез - fmoc-амінокислоти - ВЕРХ - фенілізотіоціанат - мас-спектральний аналіз:

fmoc- - - For further studies established by Galoyan, a series of experiments on the isolation, purification and determination of biological direction of peptides isolated from pigs atria were carried out. For fulfilling the biotests the preparative amount of samples was required. A modified method of solid phase peptide synthesis was used. The synthesized peptide purity and identity were defined by HPLC and mass-spectral analysis.

Solid phase synthesis - high performance liquid chromatography - mass spectrometry - fmoc-aminoacids - cardiopeptides - atria Протягом багатьох років в Інституті біохімії НАН РА у відділі біохімії нейрогормонов акад. Галояном з співробітниками вивчалися шляхи регуляції і механізми дії гіпоталамічних нейрогормонів на різні процеси в організмі.

Підтвердження ідеї про взаємопов'язаному, взаємообумовлених, цілісному функціонуванні такої системи, як гіпоталамус - гіпофіз - наднирники, стало переломним моментом в ендокринології. Поповнення ж цієї концепТВЕРДОФАЗНИЙ СИНТЕЗ КАРДІОАКТІВНОГО пептиду, виділеного з ПЕРЕДСЕРДЬ СВИНІ туальной тріади, висунутої Галояном щодо взаємодії гіпоталамус - гіпофіз

- серце, є величезним науковим досягненням. Згодом була виявлена ​​нова тканина-мішень-серце, показана здатність цього органу управляти функціонуванням специфічних пептидів, а також існування механізму зворотного зв'язку між гіпоталамусом і серцем за допомогою цих пептидів.

Виявлення кардіоактівних з'єднань - нейрогормона К, С, G і ряд інших в гіпоталамусі різних тварин послужило початком робіт не тільки з вивчення молекулярних механізмів дії цих нейрогормонів, а й з пошуку подібних з'єднань в серце. Підставою для всебічного дослідження біохімічних і фізико-хімічних властивостейкардіоактівних почав послужили дані про наявність 2-х кардіоактівних з'єднань в серцевому м'язі. Було встановлено участь нейрогормона "С" в регуляції гликолитических процесів і рівня циклічних нуклеотидів за допомогою інгібування ФДЕ цАМР, цАМФ- залежної протеїнкінази і т.д. Було показано, що ця сполука є низькомолекулярним і відноситься до глікопептидів.

Нами в лабораторії аналітичної хроматографії і пептидного синтезу була проведена робота по виділенню і очищенню з'єднань пептидної природи з передсердь і Ушкова зон серця свині. При поділі пептидних фракцій препаративної ВЕРХ, нами були виділені і очищені до гомогенного стану 20 з'єднань пептидної природи. Для визначення біологічного спрямування всі препарати були тестовані на зміни компонентів ЕКГ у щурів. Результати експериментів показали, що 7 з'єднань мають різнобічні чинники впливу на певні компоненти ЕКГ.

Пептид №7 показав найбільшу активність на зміну амплітуди компонента R, тривалості комплексу QRS, амплітуди S і інших параметрів.

Для вивчення біологічних механізмів дії даного препарату стало необхідна наявність великої кількостідосліджуваного зразка. З огляду на те, що процес виділення і очищення біопрепаратів є вкрай неефективним, трудомістким, времязатратним і не може забезпечувати хорошою відтворюваності, стало вкрай актуальним проведення хімічного синтезу даного препарату. Аналізуючи світову літературу в області хімічного синтезу пептидів, ми прийшли до висновку, що найбільш оптимальним для нас є методика твердофазного синтезу з використанням fmoc-захищених амінокислот. Відкритий в 1984 році твердофазний синтез пептидів (Solid phase peptide synthesis) має багато переваг у порівнянні зі звичайним синтезом з точки зору ефективності, а також зручної обробки і очищення.

З використанням кілька різних методик: гідролізу даного препарату, модифікування амінокислот фенілізотіоціанатом, нами було отримано амінокислотний складпептиду №7. Використовуючи дані мас-спектрального та ЯМР-аналізів, едмоновской деградації, нам вдалося отримати не тільки амінокислотний склад, але також амінокислотну послідовність пептиду №7.

Phe - Val - Pro - Ala - Met - Gly - Ile - Arg - Pro Ефективний процес твердофазного синтезу багато в чому залежить від правильного виборурізних умов його проведення, таких як вибір смоли, розчинника і кінетики проведення синтезу. Ці змінні впливають на ступінь набухання смоли і зв'язку її з амінокислотами, кількості зв'язують сайтів, що в кінцевому результаті впливає на синтез пептиду в цілому. Ми пристосувалися-ли процес твердофазного синтезу по відношенню до наших досліджуваним пептидів з урахуванням особливостей їх амінокислотної послідовності.

Г.С. ЧАІЛЯН Матеріал і методика. Всі використані реактиви, розчинники, смоли фірми "Advanced Chem Techcompany". Ми використовували fmoc-групи для захисту N-решт амінокислот в процесі синтезу і диметилформамід (DMF) як розчинник в процесі всього синтезу. В якості підкладки ми використовували кіслотолабільного 2-хлортрітільную смолу. Зняття захисних fmoc-груп проводилося за допомогою розчину пиперидина в DMF.

Дуже важливим в процесі синтезу є посадка першої амінокислоти на смолу. Два грами 2Cl-Trt-й смоли насипали в шприц об'ємом 10 мл. Набирали DMF в шприц, давали набрякнути смолі протягом 15 хв. Після цього DMF вимивався. Потім в шприц набирався розчин першої амінокислоти (fmoc-Pro) і активатор реакції (DIPEA) в співвідношенні 1СМОЛА / 1,2FMOC-PRO / 4DIPEA. Реакція посадки першої амінокислоти йшла 3 ч. Дуже важливою умовою проведення синтезу є відсутність вільних лінкерів після посадки першої амінокислоти, тому смолу після зв'язування з першої амінокислотою обробляли сумішшю метилена, DIPEA (діізопроілетіламін) і DMF в співвідношенні 80DMF / 15MEOH / 5DIPEA для блокування, можливо, залишилися вільних кінців. Після цього промивали смолу DMF 5 разів по 5 хв. Потім проводили деблокування амінокислот 30% -ним розчином піпередін в DMF 8 раз по 5 хв. Після цього смолу промивали DMF 5 разів по 5 хв. Цей цикл повторювався протягом усього синтезу пептиду. Після кожного кроку приєднання і деблокування амінокислот контроль ходу реакції перевірявся Кайзер тестом, що представляє собою реакцію нингидрина з вільною аміногрупою з утворенням характерного темно-синього кольору. Завдяки цьому тесту, став можливим покроковий контроль реакцій посадки і деблокування амінокислот.

Очищення і контроль синтезованого пептиду № 7 були проведені на 2-х компонентної препаративної системі ВЕРХ фірми Waters (USA). Для введення зразка використовувався інжектор Rheodyne з об'ємом петлі 500 мкл. Детектування проводилося в діапазоні 190-360 нм. Ми використовували колонку "Symmetry Si-100 C18" (4,6х250 mm) для обернено-фазової ВЕРХ. Швидкість потоку була 50 мл / хв. Використовувалася градиентная система елюента H2O / ACN / TFA (98/2 / 0.1) / (0.100.0.1). Час аналізу 15 хв. Рехроматографію проводили на аналітичній системі Knauer HPLC. Використовувалася колонка XbridgeC18 (2.6x150 mm). Детектування проводили при 214 нм.

Для підтвердження отриманих даних синтезований препарат був підданий массспектральному аналізу на CSU "Analitycal spectrometry".

Результати та обговорення. Дані, отримані на хроматограмі, дозволяють стверджувати, що чистота синтезованого пептиду №7 після очищення становить понад 99,6% (pіс.1).

- & nbsp- & nbsp-

Нами було проведено порівняльний хроматографический аналіз нативного пептиду №7 на колонці X-bridgeC18 в тих же умовах, що і його синтезований аналог. Результати порівняння представлені (мал. 2).

Твердофазна СИНТЕЗ КАРДІОАКТІВНОГО пептиду, виділеного з ПЕРЕДСЕРДЬ СВИНІ

- & nbsp- & nbsp-

Мал. 4. Спектрограми синтезованого (А) і нативного (В) препаратів.

Г.С. ЧАІЛЯН Як видно з порівняння хроматограмм, синтезований аналог і нативний пептид № 7 однакові за масою і часу виходу, що говорить про ідентичність їх структур і амінокислотноїпослідовності. Таким чином, використовуючи метод твердофазного синтезу пептидів і з огляду на особливості будови досліджуваного пептиду, нам вдалося отримати гомогенний і ідентичний нативному пептид, що складається з 9 амінокислот. Надалі, маючи достатню кількість препарату, ми плануємо провести ряд биотестов по виявленню не тільки шляхів регуляції серцевої діяльності цим пептидом, але також механізмів дії на інші органи і системи.

ЛІТЕРАТУРА

Попова Т.В., Срапіонян Р.М., Галоян А.А. Виявлення та ідентифікація в серце бика нових 1.

кардіоактівних білків. Зап. мед. хімії, 37, 2, с. 56-58, 1991.

Срапіонян Р.М., Саакян С.А., Саакян Ф.М., Галоян А.А. Виділення і характеристика 2.

кардіоактівного триптичного фрагмента білка-носія нейрогормона "С". Нейрохимия, 2, 3, с. 263-271, 1983.

Срапіонян, Р.М. Місірян, С.С. Поділ низькомолекулярних коронароактівних з'єднань 3.

серцевого м'яза поєднанням методів гелевою фільтрації і електрофорезу в поліакриламідному гелі. Біолог. журн. Вірменії, 27, 10, 102-104, 1974.

4. Срапіонян, Р.М. Попова, Т.В. Галоян, А.А. Розподіл кардіоактівних білкових комплексів в серце різних тварин. Біолог. журн. Вірменії, 40, 7, 588-590, 1987.

5. Galoyan A. The Regulation of Neurosecretion and Hormones of Hypothalamo-Neurohypophyseal System, USSR, 1963.

6. Galoyan A.A. Biochemistry of Novel Cardioactive Hormones and Immunomodulators of the Functional System Neurosecretory Hypothalamus, Endocrine Heart. Nauka Publ. p. 240, 1997..

7. Galoyan A.A., Besedovsky H. Handbook of Neurochemistry and molecular Neurobiology, 3rd edition, Springer Publishers, 500 p., 2008.

8. Galoyan A.A., Brain Neurosecretorycytokins: Immune Response and Neuronal Survival, VIII, 188 p., 2004.

9. Galoyan A.A., Srapionyan R.M. The purification of coronarodilatory proteins isolated from the hypothalamus. Dokl. Akad. NaukArm.SSR, 42, 4, p. 210-213, 1966.

10. March J., Smith M. March's advanced organic chemistry. Published by John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, p. 133, 2007.

- & nbsp- & nbsp-

Схожі роботи:

«СПІЛЬНОТ ВИДАВНИЦТВО« НАУКА »Москва 1979 УДК 581.55: 56.017 Пліт н і к о · в В. В. Еволюція структури рослинних угруповань. М .: Наука, с. 1979, 276 На сучасній мет ... »

«Известия Музейного Фонду ім. А.А.Браунера №2 Том I 2004 Известия Музейного Фонду ім. А. А. Браунера Том I № 2 2004 Науковий журнал Заснований у грудні 2003 р Виходить 4 рази на рік Свідоцтво про державну реєстрацію ОД № 913 від 13.12.2003 р Засновник і изда ... »

Винахід відноситься до твердофазного способу синтезу пептиду формули H-D- -Nal - Thr-NH 2, в якому використовуються і Вос-захищені, і Fmoc-захищені амінокислоти і смола з хлорметілірованного полістиролу. 10 з.п. ф-ли.

Область техніки, до якої належить винахід

Винахід стосується способу приготування пептиду, що містить три або більше амінокислотних залишків, має N-кінцеву амінокислоту, передостанню амінокислоту, прилеглу до N-кінцевий амінокислоті, і С-кінцеву амінокислоту.

Попередній рівень техніки

Твердофазний синтез пептидів був введений в 1963 р з метою подолати багато з проблем проміжних стадій очищення, пов'язаних з синтезом пептидів в розчині (Stewart et. Al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2 nd ed., 1984). При твердофазном синтезі амінокислоти збираються (наприклад, з'єднуються) в пептид будь-якої необхідної послідовності, в той час як один кінець ланцюга (наприклад, С-кінець) закріплений на нерозчинному носії. Як тільки на носії (підкладці) зібрана потрібна послідовність, пептид після цього деблокуючого (тобто отщепляют) з носія. Двома стандартними захисними групами для -аминогруппами з'єднуються амінокислот є Вос, яку видаляють сильною кислотою, І Fmoc, яку видаляють підставою. Винахід стосується зручного способу виробництва пептидів з використанням комбінації обох цих захистів для -аминогруппами в одному синтезі на недорогий смолі з хлорметілірованного полістиролу.

При розробці синтезу пептидів твердофазним способом з використанням будь-якої із зазначених вище схем захисту -аминогруппами важливо, щоб будь-які реакційно-здатні «бічні групи» складових пептид амінокислот були в ході зібрання кола захищені від небажаних хімічних реакцій. Бажано також, щоб вибрані для захисту різних бічних груп хімічні групи не віддалились реагентами, використовуваними для зняття захисту з -аминогруппами. По-третє, важливо, щоб зв'язок зростаючої пептидного ланцюга з часткою смоли була стійка до дії реагентів, які використовуються в процесі складання ланцюга для видалення будь-яких типів захисту -аминогруппами. У разі схеми захисту -аминогруппами з використанням Fmoc, захист бічних груп повинна бути стійка в дії лужних реагентів, які використовуються для видалення Fmoc. На практиці ці захисні групи для бічних ланцюгів зазвичай видаляють слабо кислотними реагентами після завершення збирання пептидного ланцюга. Якщо використовується схема захисту -аминогруппами з використанням Вос, захист бічних груп повинна бути стійка в дії слабо кислотного реагенту, що використовується для зняття групи Вос в кожному циклі. На практиці ці захисні групи для бічних ланцюгів в схемі захисту -аминогруппами за допомогою Вос зазвичай видаляють безводних HF після завершення збирання пептидного ланцюга. Таким чином, на практиці повсюдно використовуються для захисту бічних ланцюгів групи в схемі із захистом -аминогруппами за допомогою Fmoc нестабільні в умовах, які використовуються для зняття з -аминогруппами захисних груп Вос. Тому два типи схем захисту -аминогруппами при складанні пептидного ланцюга в твердофазном синтезі пептидів не об'єднують. Крім того, хоча застосовується в пептидному синтезі найбільш дешеву полімерну смолу (хлорметілірованний полістирол або «смола Меріфілда») широко використовують разом з амінокислотами, захищеними групами Вос, в літературі зроблено висновок, що вона непридатна в разі захисту -аминогруппами групами Fmoc через її нестабільності в лужних умовах (див. Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2 nd ed., 1984). Даний винахід націлене на спосіб спільного використання в ході твердофазного синтезу деяких пептидів і Вос-захищених, і Fmoc-захищених амінокислот на смолі Меріфілда.

Відомо, що Lanreotide®, який є аналогом соматостатину, уповільнює вивільнення гормону росту, а також пригнічує секрецію інсуліну, глюкагону і екзокринну панкреатичну секрецію.

Патент США № 4853371 розкриває і заявляє Lanreotide®, спосіб його отримання і спосіб інгібування секреції гормону росту, інсуліну, глюкагону і екзокринної панкреатичної секреції.

Патент США № 5147856 розкриває застосування Lanreotide® для лікування рестенозу.

Патент США № 5411943 розкриває застосування Lanreotide® для лікування гепатоми.

Патент США № 5073541 розкриває застосування Lanreotide® для лікування раку легенів.

Заявка на патент США № 08/089410, зареєстрована 9 липня 1993 р розкриває застосування Lanreotide® для лікування меланоми.

Патент США № 5504069 розкриває застосування Lanreotide® для пригнічення прискореного зростання твердої пухлини.

Заявка на патент США № 08/854941, зареєстрована 13 травня 1997 р розкриває застосування Lanreotide® для зниження ваги тіла.

Заявка на патент США № 08/854943, зареєстрована 13 травня 1997 р розкриває застосування Lanreotide® для лікування стійкості до інсуліну і синдрому X.

Патент США № 5688418 розкриває застосування Lanreotide® для продовження життєздатності панкреатичних клітин.

Заявка РСТ № PCT / US 97/14154 розкриває застосування Lanreotide® для лікування фіброзу.

Заявка на патент США № 08/855311, зареєстрована 13 травня 1997 року, розкриває застосування Lanreotide® для лікування гіперліпідемії.

Заявка на патент США № 08/440061, зареєстрована 12 травня 1995 р розкриває застосування Lanreotide® для лікування гіперамілінеміі.

Заявка на патент США № 08/852221, зареєстрована 7 травня 1997 р розкриває застосування Lanreotide® для лікування гіперпролактинемії і пролактіном.

суть винаходу

Даний винахід надає спосіб приготування пептиду, що містить три або більше амінокислотних залишків, має N-кінцеву амінокислоту, передостанню амінокислоту, прилеглу до N-кінцевий амінокислоті, і С-кінцеву амінокислоту, причому зазначений спосіб включає наступні етапи:

(А) прикріплення першої амінокислоти до твердого носія - смолі - ефірним зв'язком з утворенням продукту першого приєднання, що включає (i) проведення реакції водного розчинукарбонату цезію зі спиртовим розчином першої амінокислоти з утворенням цезієвої солі першої амінокислоти, (ii) отримання вільної від розчинника цезієвої солі першої амінокислоти, (iii) проведення реакції твердого носія смоли з цезієвої сіллю першої амінокислоти в сухому (безводному) полярному апротонному розчиннику з утворенням продукту першого приєднання,

де перша амінокислота відповідає С-кінцевий амінокислоті пептиду, аминогруппа небоковой (основний) ланцюга першої амінокислоти блокована Воc, і перша амінокислота не має в бічному ланцюзі функціональної групи, для якої потрібен захист, і твердий носій - смола - являє собою смолу з хлорметілірованного полістиролу;

(Б) зняття захисту (деблокування) Воc з продукту першого приєднання кислотою з утворенням деблокувати продукту першого приєднання;

(В) на розсуд, приєднання до деблокувати продукту першого приєднання наступної амінокислоти, що включає проведення реакції наступної амінокислоти з деблокувати продуктом першого приєднання в органічному розчиннику, що містить реагент для нарощування пептиду, з отриманням блокованого (захищеного) продукту наступного приєднання, причому наступна амінокислота має в основному ланцюзі аміногрупу, блокований Воc, і якщо наступна амінокислота має одну або кілька функціональних груп в бічному ланцюзі, тоді функціональні групи в бічному ланцюзі не вимагають захисту або функціональні групи в бічному ланцюзі мають захисні групи, які стійкі до кислотних або лужних реагентів, що використовуються для зняття захисту відповідно Воc і Fmoc;

(Г) зняття захисту Воc з блокованого продукту наступного приєднання, що включає проведення реакції блокованого продукту наступного приєднання з кислотою з одержанням деблокувати продукту наступного приєднання;

(Д) на розсуд, повторення етапів (в) і (г), причому в кожному циклі утворюється деблокувати продукт (Х + 1) -го наступного приєднання, де Х - номер необхідного повторення циклу;

(Е) приєднання наступної амінокислоти до деблокувати продукту першого приєднання з етапу (б) або, на розсуд, до деблокувати продукту (Х + 1) -го наступного приєднання з етапу (д), що включає проведення реакції наступної амінокислоти з зазначеним продуктом першого приєднання або з зазначеним деблокувати продуктом (Х + 1) -го наступного приєднання в органічному розчиннику, що містить реагент для нарощування пептиду з одержанням блокованого (захищеного) продукту наступного приєднання, причому наступна амінокислота має блокований Fmoc аминогруппу основному ланцюзі, за умови, що якщо наступна амінокислота має одну або кілька функціональних груп в бічному ланцюзі, тоді функціональні групи в бічному ланцюзі не вимагають захисту або функціональні групи в бічному ланцюзі мають захисні групи, які стійкі до лужних реагентів, що використовуються для зняття захисту Fmoc;

(Ж) зняття захисту Fmoc з блокованого продукту наступного приєднання, що включає проведення реакції блокованого продукту наступного приєднання з первинним або вторинним аміном, щоб отримати деблокувати продукт наступного приєднання;

(З) на розсуд, повторення етапів (е) і (ж), причому в кожному циклі утворюється деблокувати продукт (Х + 1) -го наступного приєднання, де Х - номер необхідного повторення циклу, поки не буде включена в пептид і деблокувати передостання амінокислота;

(І) приєднання N-кінцевої амінокислоти до деблокувати продукту (Х + 1) -го наступного приєднання, що включає проведення реакції N-кінцевої амінокислоти з деблокувати продуктом (Х + 1) -го наступного приєднання в органічному розчиннику, що містить реагент для нарощування пептиду , з отриманням блокованого продукту завершеного приєднання, де N-кінцева амінокислота має аминогруппу основному ланцюзі, блокований Вос або Fmoc;

(Й) зняття захисних груп Воc або Fmoc з блокованого продукту завершеного приєднання, що включає проведення реакції блокованого продукту завершеного приєднання з кислотою в разі Вос або з основою в разі Fmoc, з утворенням завершеного пептидного продукту на смолі;

(К) якщо на завершеному пептидному продукті на смолі є функціональні групи бічних ланцюгів, тоді, на розсуд, зняття захисту функціональних груп бічних ланцюгів завершеного пептидного продукту на смолі, що включає проведення реакції завершеного пептидного продукту на смолі з відповідними знімають захист реагентами з отриманням завершеного пептидного продукту на смолі зі знятою захистом; і

(Л) відщеплення пептиду від твердого носія смоли в складі завершеного пептидного продукту на смолі або завершеного пептидного продукту на смолі зі знятою захистом з отриманням пептиду, що включає проведення реакції завершеного пептидного продукту на смолі або завершеного пептидного продукту на смолі зі знятою захистом з аміаком, первинним аміном або вторинним аміном до практичного завершення відщеплення пептиду від смоли;

за умови, що етапи (е) і (ж) в синтезі пептиду повинні бути здійснені щонайменше один раз.

Кращим є спосіб відповідно до даного винаходу, де аміак, первинний амін або вторинний амін в етапі (л) знаходяться в розчиннику, що містить спирт і, на розсуд, апротонний полярний розчинник,

Кращим є спосіб відповідно до даного винаходу, де етап (л) додатково включає наступні етапи:

осадження відщеплення пептиду з розчинника;

відділення фільтруванням твердого носія смоли і обложеного пептиду і

екстрагування пептиду кислотним розчином для виділення пептиду.

Кращим є спосіб відповідно до даного винаходу, де перша амінокислота є Boc-L-Thr.

Кращим є спосіб відповідно до даного винаходу, де перша амінокислота є цезієві сіль Boc-L-Thr, що дає в якості продукту першого приєднання Boc-L-Thr-смолу, а деблокувати продуктом першого приєднання є H-L-Thr-смола.

Кращим є спосіб відповідно до даного винаходу, де кислотою, використовуваної для видалення захисної групи Воc в етапі (й), є трифтороцтова кислота (ТФУ).

Кращим способом, що належать до безпосередньо попереднього способу, є спосіб, де органічним розчинником є ​​метилен-хлорид, хлороформ або диметилформамід, а реагентом для нарощування пептиду є діізопропіл-карбодиїмідів, діціклогексіл-карбодиїмідів або N-етил-N "- (3-диметил амінопропіл) карбодиїмідів.

Кращим способом, що належать до безпосередньо попереднього способу, є спосіб, який включає проведення етапів (е) і (ж) шість разів після освіти деблокувати продукту першого приєднання формули HL-Thr-смола, де наступні амінокислоти приєднуються в порядку: Fmoc-L-Cys ( Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys (Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr (Ot-Bu) і Fmoc-L-Cys (Acm) з утворенням продукту Н-Cys ( Acm) -Tyr (Ot-Bu) -D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys (Acm) -Thr-смола.

Кращим способом, що належать до безпосередньо попереднього способу, є спосіб, що включає приєднання Boc-D- -Nal до H-Cys (Acm) -Tyr (Ot-Bu) -D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys (Acm) -Tnr-смолі згідно етапу (в) з отриманням Boc-D- -Nal-Cys (Acm) -Tyr (Ot-Bu) -D-Trp-Lys (Boc) -Val-Сys (Аст) -Thr-смоли.

Переважний спосіб, що відноситься до безпосередньо попереднього способу, включає одночасне зняття групи Воc, що захищає D- -Nal, групи Ot-Bu, що захищає Тyr, і групи Воc, що захищає Lys в Boc-D- -Nal-Cys (Acm) -Tyr ( Ot-Bu) -D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys (Acm) -Тhr-смолі згідно етапу (і), з отриманням завершеного пептидного продукту на смолі формули HD- -Nal-Cys (Acm) -Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-смола.

Переважний спосіб, що відноситься до безпосередньо попереднього способу, включає відщеплення пептиду HD- -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr від твердої смоли шляхом проведення реакції HD- -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-смоли з аміаком в розчиннику, що містить спирт і, на розсуд, апротонний полярний розчинник, до практично повного відщеплення з отриманням HD- -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-NH 2.

Кращим способом, що належать до безпосередньо попереднього способу, є спосіб, де спиртом є метанол, а полярний апротонний розчинник - це диметилформамид.

Переважний спосіб, що відноситься до безпосередньо попереднього способу, включає одночасне видалення груп Асm, що захищають Сys, і циклізація виходять залишків Cys зі знятою захистом в завершеному пептидному продукті формули HD- -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val -Сys (Асm) -Тhr-NH 2 шляхом проведення реакції HD- -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-NH 2 з розчином йоду в спирті до практично повних зняття захисту і циклізації з одержанням HD- -Nal - Thr-NH 2.

Кращим способом, що належать до безпосередньо попереднього способу, є спосіб, де пептид являє собою H-D- -Nal - Thr-NH 2.

Кращим способом, що належать до безпосередньо попереднього способу, є спосіб, де пептид є аналогом соматостатину.

Терміни, використані в описі винаходу, визначаються наступним чином:

«Перша амінокислота»: охоплює будь-яку амінокислоту, у якій в основному ланцюзі (не в бічній) аминогруппа захищена Воc, яка є комерційним продуктом або може бути синтезована відповідно до методам, відомим фахівцеві зі звичайним досвідом в цій галузі, наприклад Boc-L-Тhr;

«Продукт першого приєднання»: описує продукт, який прикріплений до твердого - носію - смолі, що є результатом приєднання першої амінокислоти до твердого носія - смолі, наприклад Boc-L-Thr-смола;

«Деблокувати продукт першого приєднання»: описує продукт, який є результатом видалення або зняття групи Воc з продукту першого приєднання - наприклад, H-L-Тhr-смола, де «Н» є доступний водень аміногрупи основному ланцюзі, що з'являється в результаті етапу деблокування;

«Наступна амінокислота»: описує будь-яку амінокислоту, у якій в основному ланцюзі аминогруппа захищена Воc або Fmoc, яка є комерційним продуктом або може бути синтезована відповідно до методам, відомим фахівцеві зі звичайним досвідом в даній області. Оскільки етап (в) і етап (е) можуть входити в повторюваний цикл, де етап здійснюється більш ніж один раз, кожен раз при здійсненні етапу (в) або етапу (е) «наступна амінокислота» може бути незалежно обрана з групи відомих або можуть бути синтезованими амінокислот, у яких в основному ланцюзі аминогруппа захищена Воc або Fmoc;

«Блокований продукт (Х + 1) -го наступного приєднання»: описує продукт, приєднаний до твердого носія смолі, який є результатом з'єднання наступної амінокислоти зі «деблокувати продуктом наступного приєднання». Оскільки етапи (в) і (г) і етапи (е) і (ж) можуть входити в повторюваний цикл, де можуть бути приєднані такі амінокислоти, термін «блокований продукт (Х + 1) -го наступного приєднання» відноситься до продукту, що отримується в результаті кожного з попередніх циклів приєднання;

«Деблокувати продукт (Х + 1) -го наступного приєднання»: описує продукт, який є результатом зняття групи Fmoc з «блокованого продукту (Х + 1) -го наступного приєднання»;

«Завершений пептидний продукт на смолі»: описує пептидний продукт, прикріплений до твердого носія смолі після того, як до пептидного ланцюга була приєднана N-кінцева амінокислота, і після того, як знято або деблокувати захист з аміногрупи основному ланцюзі N-кінцевої амінокислоти, але який ще має будь-які захисні групи на функціональних групах бічних ланцюгів, не видалені реакцією, що здійснює зняття захисної групи з основного кола N-кінцевої амінокислоти; і

«Завершений пептидний продукт на смолі зі знятою захистом»: описує пептидний продукт, прикріплений до твердого носія - смолі, де були видалені або зняті всі захисні групи з функціональних груп бічних ланцюгів амінокислот.

Прикладами кислот, які можна використовувати для зняття захисту Воc, є трифтороцтова кислота (ТФУ), метансульфонова кислота і органічні розчини, що містять НСl.

Прикладами первинних і вторинних амінів, які можуть бути використані для зняття захисту Fmoc, є 4- (амінометил) піперидин, піперидин, діетиламін, DBU і трис (2-аміноетил) амін.

Прикладами ненуклеофільних підстав, які можна використовувати для нейтралізації солей ТФУ звільнених аминогрупп (RNH 3 + CF 3 COO -, ці солі повинні бути перетворені в «вільні» аміни (NH 2) до або під час приєднання наступної амінокислоти, інакше приєднання не здійсниться) є діізопропілетиламін (ДІЕА) і триетиламін (ТЕА).

Прикладами органічних розчинників, які можуть бути використані в реакціях приєднання амінокислот, є метилен-хлорид, хлороформ, дихлоретан, диметилформамід, діетілацетамід, тетрагідрофуран, етилацетат, 1-метил-2-піролідон, ацетонітрил або комбінація цих розчинників.

Приклади агентів для нарощування пептидів включають заміщені карбодиїмідів, такі як: діізопропіл-карбодиїмідів, діціклогексіл-карбодиїмідів або N-етил-N "- (3-диметил-амінопропіл) карбодиїмідів.

Карбоксильні групи і аміногрупи, які беруть участь в утворенні пептидного амідного зв'язку, називають відповідно карбоксильною групою або аминогруппой «небоковой (основний) ланцюга». З іншого боку, будь-які функціональні групи амінокислоти, які не беруть участі в утворенні пептидного амідного зв'язку, називають функціональними групами «бічного ланцюга».

Термін «стійка до дії підстав група» відноситься до захисних груп, використовуваним для захисту функціональних груп амінокислот, які (1) стійкі до дії підстав, наприклад не можуть бути видалені підставами, такими як 4- (аміноетил) піперидин, піперидин або трис (2 -аміноетіл) амін, які є підставами, зазвичай використовуваними для видалення захисної групи Fmoc, і (2) можуть бути видалені кислотою, такий як трифтороцтова кислота, або іншим способом, таким як каталітична гідрогенізація.

Символи «Fmoc» і «Воc» використані тут і в поданій формулі для позначення відповідно 9-флуореніл-метоксикарбоніл і трет-бутил-оксікарбоніла.

Описаний вище спосіб може бути застосований для приготування пептидів, переважно аналогів соматостатину, таких як октапептид Lanreotide®, який має наступну формулу: H-D- -Nal - Thr-NH 2. Якщо потрібно синтезувати H-D- -Nal - Тhr-NH 2, стійкими до дії підстав захисними групами, використовуваними для захисту функціональних груп бічних ланцюгів Cys, Lys і Тyr, можуть бути відповідно ацетамідометіл (Асm), Воc і трет-бутил. Асm кращий для Cys.

Під аналогом соматостатину мається на увазі пептид, який проявляє біологічну активність, подібну (тобто агонист) або протилежну (тобто антагоніст) активності соматостатина.

У формулі H-D- -Nal - Thr-NH 2 кожен зі звичайних трибуквених символів амінокислот (наприклад, Lys) відноситься до структурному залишку амінокислоти. Наприклад, символ Lys в наведеній вище формулі являє -NН-СН ((СН 2) 4 NН 2) -СО-. Символ D- -Nal- представляє амінокислотний залишок D-2-нафтілаланіліл. Дужки позначають дисульфидную зв'язок, що з'єднує вільні Меркаптани двох залишків Cys в пептиді, це вказує на те, що амінокислоти пептиду всередині дужок утворюють цикл.

На підставі наведеного тут опису фахівець в даній області зможе в найбільш повній мірі використовувати даний винахід.

Якщо не передбачено інше, всі використані тут технічні та наукові терміни мають те ж саме значення, яке зазвичай розуміють фахівці зі звичайним рівнем підготовки в області, до якої належить даний винахід. Крім того, всі публікації, патентні заявки, патенти та інші наведені тут ссипкі включені сюди посиланням на них.

Пептид може бути приготований у відповідності зі способом винаходу за такою процедурою.

Розчин 0,5 молярних еквівалентів карбонату цезію у воді повільно додають до розчину 1 молярного еквівалента Вос-АА 1 (Bachem California, Torrance, СА), де АА 1 відповідає С-кінцевий амінокислоті, розчиненої в спирті, переважно метанолі. Отриману суміш перемішують протягом близько 1 ч при кімнатній температурі, потім весь спирт і всю воду видаляють при зниженому тиску, одержуючи сухий порошок цезієвої солі Вос-АА 1. Смолу Меріфілда, 1,0 еквівалент (хлор-метильований полістирол, 200-400 меш, включення іонів хлору 1,3 мекв / г, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky або Polymer Laboratories, Church Stretton, England) промивають хлорованим розчинником, переважно діхлорметаном ( ДХМ), спиртом, переважно метанолом, і полярним апротонного розчинником, переважно диметилформамидом (ДМФ). Порошок цезієвої солі Вос-АА 1 розчиняють в безводному (сухому) полярному апротонному розчиннику, переважно ДМФ, і розчин об'єднують з попередньо промитої смолою. Кашку акуратно перемішують при приблизно 45 ° -65 ° С, переважно при 50 ° -60 ° С, протягом приблизно від 48 до 106 ч, переважно від 85 до 90 год, в інертному атмосфері - такий як азот. Смолу відокремлюють фільтруванням і ретельно промивають полярним апротонного розчинником, переважно ДМФ, водою і остаточно спиртом - таким як МеОН. Вос-АА 1 -смолу сушать при зниженому тиску.

Вос-АА 1 -смолу вносять в скляний реактор з фільтруючим дном з крупнопористого сплавленного скла. Смолу промивають хлорованим розчинником - таким як ДХМ, деблокуючого органічною кислотою, переважно 25% ТФУ в ДХМ, короткочасно промивають хлорованим розчином - таким як ДХМ, і спиртом - таким як МеОН, нейтралізують органічним підставою, переважно триетиламіном в ДХМ, і знову промивають ДХМ та полярним апротонного розчинником - таким як ДМФ, отримуючи AA 1 -смолу зі знятою захистом.

Потім до АА 1 -смоле зі знятою захистом на розсуд приєднують будь-яке необхідне число амінокислот. Якщо наступна амінокислота має -аминогруппами із захистом Fmoc (Fmoc-AA x), тоді групі бічного ланцюга або немає потреби в захисті (це, наприклад, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe або Fmoc-Thr), або бічний ланцюг необхідно захистити групою, стійкої до дії підстави. Молярний надлишок Fmoc-AA x (де х - номер положення амінокислоти в пептиді, відлічуваний від С-кінця) приєднують протягом приблизно 60 хв до АА 1 -смоле зі знятою захистом за допомогою реагенту для нарощування пептиду - такого як діізопропілкарбодіімід (ДІК), в суміші ДХМ / ДМФ. Смолу з приєднанням промивають ДМФ, спиртом і ДХМ, одержуючи Fmoc-АА x -АА 1 -смолу. Прикріплення можна перевірити Нінгідринова методом Кайзера. Потім Fmoc-AA x -АА 1 -смолу промивають один раз ДМФ і після цього деблокуючого розчином підстави в органічному розчиннику, такому як піперидин в ДМФ, отримуючи АА x -АА 1 -смолу. Потім AA x -АА 1 -смолу промивають ДМФ, після чого кілька разів промивають і спиртом, таким як МеОН, і ДХМ. Після цього AA x -АА 1 -смолу промивають один раз ДМФ протягом приблизно 3 хв, три рази ізопропанолом, переважно кожен раз протягом приблизно 2 хв, і три рази ДХМ, переважно кожен раз протягом приблизно 2 хв. Після цього смола готова для подальшого приєднання або амінокислоти, захищеної Fmoc, як описано вище, або амінокислоти, захищеної Воc, як описано далі.

Подібним же чином, якщо будь-яка підлягає приєднанню до АА 1 -смоле зі знятою захистом подальша амінокислота вибрана з захищеної Воc -аминогруппами (Вос-АА x), тоді або для групи бічного ланцюга немає потреби в захисті (це можуть бути Boc-Gly, Boc- Ala, Boc-Phe або Boc-Thr), або бічний ланцюг повинна бути захищена групою, стійкої до видалення і кислотою, і підставою, - це може бути Boc-Cys (Acm). Якщо обрана Вос-АА x, її приєднують за допомогою таких же реагентів і розчинників, як в описаному вище випадку для Fmoc-амінокислот, і повноту (завершення) приєднання можна перевірити Нінгідринова методом Кайзера. Після цього з Вос-АА x -АА 1 -смоли знімають захист розчином кислоти в органічному розчиннику - таким як ТФУ в ДХМ, одержуючи CF 3 CO - H + -AA x -АА 1 -смолу. Потім цю смолу кілька разів промивають хлорованими розчинниками, такими як ДХМ, спиртом, таким як МеОН, і нейтралізують ненуклеофільним основою, наприклад, триетиламін в ДХМ, після чого промивають ще кілька разів хлорованим розчинником, таким як ДХМ, одержуючи АА x -АА 1 - смолу. Після цього смола готова для подальшого приєднання захищеної Воc або Fmoc амінокислоти, як описано вище.

Залежно від необхідної послідовності пептиду і типу використаної амінокислоти з захищеною -аминогруппами (або із захистом Fmoc, або з захистом Воc) використовують відповідну комбінацію описаних вище процедур приєднання, залежно від того, яка амінокислота повинна зайняти місце в пептидного послідовності - з бічним ланцюгом , що має захисну групу, яку можна видалити або підставою, необхідною для зняття Fmoc з -аминогруппами, або кислотою, необхідною для зняття Воc з -аминогруппами. Такий захищеної амінокислотою може бути N- -Boc-N "- -Fmoc-лізин або N- -Fmoc-N" - -Вос-лізин. Якщо це має місце, все обрані захисні групи для -аминогруппами наступних амінокислот, аж до N-кінцевої амінокислоти, повинні бути сумісними з обраної для цього положення захистом бічний групи. Це означає, що захисні групи бічних ланцюгів повинні бути стійкі до деблокуючого агенту, що використовується для зняття захисту з -аминогруппами наступних амінокислот. Для N-кінцевої амінокислоти в якості захисту -аминогруппами можна використовувати або Воc, або Fmoc, так як зняття захисту з N-кінцевої амінокислоти може одночасно зняти захист з деяких із захищених бічних ланцюгів без небажаного впливу на стратегію синтезу пептиду, оскільки ніякі амінокислоти більше не додаються.

З завершеною пептидного ланцюга, яка ще прикріплена до смолі, повинна бути знята захист і вона повинна бути деблокувати. Щоб видалити всі стійкі до дії підстав захисні групи і групи, що блокує -аминогруппами N-кінцевої амінокислоти, якщо вони можуть бути застосовані, пептид на смолі обробляють кислотою в органічному розчиннику - такий як ТФУ в ДХМ. Щоб видалити всі стійкі до дії кислоти захисні групи і групи, що блокує -аминогруппами N-кінцевої амінокислоти, якщо вони можуть бути застосовані, пептид на смолі обробляють органічним підставою - таким як піперидин в ДМФ. Або ж стійкі до кислоти групи можна залишити надалі до видалення при подальшому відщепленні пептиду аміаком або амінами підставою. Потім пептид на смолі зі знятою захистом промивають хлорованим розчинником - таким як ДХМ, спиртом - таким як МеОН, і сушать до постійної ваги при зниженому тиску.

Пептид отщепляют від смоли і С-кінець переводять в амід, суспендіруя пептид на смолі в суміші 3: 1 МеОН / ДМФ. Суспензію охолоджують до температури приблизно нижче 10 ° С в атмосфері азоту і під поверхню розчинника вводять безводний газоподібний аміак до насичення їм розчину, при цьому температуру підтримують нижче приблизно 10 ° С. Кашку акуратно перемішують протягом приблизно 24 год, дозволяючи при цьому температурі підвищитися до приблизно 20 ° С. Ступінь завершення реакції перевіряють по зникненню метил-ефірного проміжного з'єднання в ВЕРХ при відповідних умовах, що залежать від типу пептиду. Реакційну суміш охолоджують і додають необхідну кількість безводного аміаку, поки при ВЕРХ площа піку, відповідного метилового ефіру, не стане менше 10% площі піку цільового продукту. Кашку охолоджують до температури нижче приблизно 10 ° С і продовжують перемішування протягом ночі для осадження пептиду. Осад і смолу відокремлюють фільтруванням і промивають холодною МеОН. Осад і смолу сушать при зниженому тиску, продукт екстрагують з смоли водним розчином оцтової кислоти.

Якщо пептид в своїй послідовності містить захищені залишки Сys, захист з тіольний груп можна зняти і ціклізовать залишки за такою процедурою. Містить захищені Асm групи Cys пептид розчиняють у водному розчині оцтової кислоти в атмосфері азоту. Розчин швидко перемішують і додають в одній порції розчин йоду в спирті. Суміш перемішують і перевіряють за допомогою ВЕРХ повноту зняття захисту. Потім реакцію зупиняють титруванням 2% розчином тіосульфату натрію до зникнення забарвлення розчину. Неочищену суміш необхідно чистити за допомогою препаративної хроматографії на патроні С8 з градієнтом ацетонітрилу в 0,1 буфері ацетату амонію, обессолівают на патроні С8 з градієнтом ацетонітрилу в 0,25 н оцтової кислоти і ліофілізуют, отримуючи цільової пептид.

Приклад здійснення винаходу

Наступний приклад наведено для того, щоб проілюструвати спосіб відповідно до даного винаходу, і він не повинен розглядатися як обмеження його охоплення.

Приклад 1. H 2 -D- -Nal - Thr-NH 2

А) Boc-L-Thr-смола

Розчин 2,58 г карбонату цезію в 2,5 мл води повільно додавали до розчину 3,48 г Boc-L-треоніну (Bachem California, Torrance, СА), розчиненого в 7 мл метанолу. Отриману суміш перемішували протягом приблизно 1 год при кімнатній температурі, потім видаляли весь метанол і всю воду при зниженому тиску, одержуючи сухий порошок цезієвої солі Boc-L-треоніну. 10 г смоли Меріфілда (хлорметілірованний полістирол, 200-400 меш, включення хлору 1,3 мекв / г, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky) промили діхлорметаном (ДХМ), метанолом (МеОН) і диметилформамидом (ДМФ) (кожним 2 рази по 70 мл). Порошок цезієвої солі Boc-L-треоніну розчинили в 60 мл сухого ДМФ і об'єднали розчин з промитої, як зазначено вище, смолою. Кашку акуратно перемішували при температурі приблизно 50 ° -60 ° С протягом приблизно від 85 до 90 год в атмосфері азоту. Смолу відокремили фільтруванням і ретельно промили ДМФ, деионизованной водою і наостанок МеОН. Смолу з Вос-треонін сушили при зниженому тиску при приблизно 40 ° С. Включення треонина склало 0,85 ± 0,15 ммоль / г сухої смоли.

Б) H-D- -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-смола

2,0 г смоли з Вос-треонін з етапу (А) внесли в скляний реактор об'ємом 50 мл з дном-фільтром з крупнопористого сплавленного скла (завантаження 1,74 ммоль). Смолу промили 2 рази ДХМ (20 мл), кожен раз протягом приблизно 5 хв, деблокували 25% ТФУ в ДХМ (30 мл) - перший раз протягом приблизно 2 хв і вдруге протягом приблизно 25 хв, промили 3 рази протягом приблизно 2 хв ДХМ (20 мл), ізопропанолом (20 мл) і ДХМ (20 мл), нейтралізували двічі протягом близько 5 хв 10% розчином триетиламіну в ДХМ (20 мл), промили 3 рази протягом приблизно 2 хв ДХМ і промили один раз ДМФ (20 мл) протягом приблизно 5 хв.

До деблокувати смолі додали 1,8 г (4,35 ммоль, 2,5 екв.) Fmoc-L-цистеїну (Асm) (Bachem, СА) і 683 мкл (4,35 ммоль, 2,5 екв.) Діізопропіл- карбодиїмідів (ДІК) в 14 мл суміші 2: 1 ДХМ / ДМФ приблизно на 1 ч. Після приєднання смолу промили 1 раз протягом близько 3 хв ДМФ (20 мл), 3 рази протягом близько 2 хв ізопропанолом і 3 рази протягом близько 2 хв ДХМ (20 мл). Зв'язування перевірили нігідріновим методом Кайзера.

Після приєднання смолу промили 1 раз ДМФ і потім деблокували розчином піперидину в ДМФ. Потім деблокувати смолу з приєднанням промили ДМФ і кілька разів одночасно МеОН і ДХМ. Смолу з приєднанням промили 1 раз протягом близько 3 хв ДМФ (20 мл), 3 рази протягом близько 2 хв ізопропанолом (20 мл) і 3 рази ДХМ (20 мл) протягом близько 2 хв кожен раз. Зв'язування перевірили Нінгідринова методом Кайзера.

Кожну з таких захищених амінокислот приєднували до промитої смолі, використовуючи ДІК в суміші ДМФ / ДХМ, і деблокували, як описано вище, в такій послідовності: Fmoc-L-валін, Fmос-L-лізин (Вос), Fmoc-D-триптофан, Fmoc-L-тирозин (О-t-Bu) і Fmос-L-цистеїн (Асm) (всі від фірми Bachem California), Boc-D-2-нафтілаланін (Synthethech, Albany, OR).

З завершеною пептидного ланцюга знімали блокування і захист двічі сумішшю 75: 20: 5 ДХМ / ТФУ / анізол (30 мл) протягом близько 2 хв і близько 25 хв, промили 3 рази протягом близько 2 хв кожен раз ДХМ (20 мл), ізопропанолом (10 мл) і ДХМ (20 мл), нейтралізували 2 рази протягом близько 5 хв 10% розчином триетиламіну в ДХМ (20 мл) і промили 3 рази протягом близько 2 хв ДХМ (20 мл) і МеОН (20 мл) . Смолу сушили при зниженому тиску. Суха вага дорівнював 3,91 г (103% від теоретичного виходу).

B) H-D- -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-NH 2

2,93 г навантаженої пептидом смоли з етапу (Б) (1,3 ммоль-екв.) Суспендованих в 50 мл суміші 3: 1 МеОН / ДМФ. Суспензію охолодили до температури приблизно нижче 10 ° С в атмосфері азоту і продували сухий газоподібний аміак до насичення їм розчину, при цьому температуру підтримували нижче приблизно 10 ° С. Кашку акуратно перемішували протягом приблизно 24 год, дозволяючи температурі підвищитися до приблизно 20 ° С. Ступінь завершення реакції перевіряли по зникненню метил-ефірного проміжного з'єднання за допомогою ВЕРХ (сорбент VYDAC®, розмір зерен 5 мкм, розмір пір 100 Å, С18, елюювання в ізократіческіх умовах 26% CH 3 CN в 0,1% ТФУ, швидкість 1 мл / хв, реєстрація при 220 мм; в цих умовах час ретардації Rt ~ 14 хв для метилового ефіру і ~ 9,3 хв для амідного продукту). Реакційну суміш охолоджували і додавали надлишок безводного аміаку, поки при ВЕРХ площа піку, відповідного метилового ефіру, не стала менше 10% площі піку цільового продукту. Кашку охолодили до температури приблизно нижче 10 ° С, перемішування продовжували протягом ночі для осадження пептиду. Осад і смолу відокремили фільтруванням і промили 15 мл холодного МеОН. Осад і смолу висушили при зниженому тиску, продукт екстрагували з смоли 50% водним розчином оцтової кислоти (3 порції по 30 мл). Аналіз методом ВЕРХ показав наявність в суміші 870 мг (0,70 ммоль) титульного продукту (96% чистота в ізократіческой системі ВЕРХ).

Г) H-D- -Nal - Thr-NH 2

500 мг (0,40 ммоль) пептиду з етапу (В) розчинили в 300 мл 4% оцтової кислоти і нагріли до приблизно 55 ° С в атмосфері азоту. Розчин швидко перемішали і додали однією порцією 2% розчин (вага до обсягу) йоду в 7,7 мл МеОН (0,60 ммоль). Суміш перемішували протягом приблизно 15 хв, потім реакцію зупинили титруванням 2% розчином тіосульфату натрію до зникнення забарвлення (~ 2 мл). Суміш охолодили до кімнатної температури і профільтрували. Суміш піддали очищення за допомогою препаративної хроматографії на колонці С8 (YMC, Inc., Wilmington, NC) з градієнтом ацетонітрилу в 0,1 М ацетат амонію, знесолити на колонці С8 YMC з градієнтом ацетонітрилу в 0,25 н оцтової кислоти і ліофілізований, отримавши 350 мг цільового пептиду з чистотою 99%.

На підставі наведеного вище опису фахівець даної галузі може легко з'ясувати істотні характеристики винаходу і без виходу за межі його ідеї і області охоплення зробити різні зміни і модифікації винаходу для пристосування його до різним вживанням і умов. Таким чином, інші варіанти здійснення винаходу також охоплюються формулою винаходу.

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб приготування пептиду формули H-D- -Nal - Thr-NH 2, причому зазначений спосіб включає наступні етапи:

(А) прикріплення першої амінокислоти до твердого носія смолі ефірним зв'язком з утворенням «продукту першого приєднання», що включає (i) проведення реакції водного розчину карбонату цезію зі спиртовим розчином першої амінокислоти з утворенням цезієвої солі першої амінокислоти, (ii) отримання вільної від розчинника цезієвої солі першої амінокислоти, (iii) проведення реакції твердого носія смоли з цезієвої сіллю першої амінокислоти в безводному полярному апротонному розчиннику з утворенням «продукту першого приєднання»,

де перша амінокислота є Boc-L-Thr, що відповідає С-кінцевий амінокислоті цього пептиду, а твердий носій смола являє собою смолу з хлорметілірованного полістиролу;

(Б) зняття захисту Вос з продукту першого приєднання кислотою з утворенням «деблокувати продукту першого приєднання»;

(В) на розсуд, приєднання до «деблокувати продукту першого приєднання» «Наступного амінокислоти», що включає проведення реакції «наступної амінокислоти» з «деблокувати продуктом першого приєднання» в органічному розчиннику, що містить реагент для нарощування пептиду, з отриманням «блокованого продукту наступного приєднання », причому« наступна амінокислота »має в основному ланцюзі аміногрупу, блокований Вос, і якщо ця« наступна амінокислота »має одну або кілька функціональних груп в бічному ланцюзі, тоді функціональні групи в бічному ланцюзі не вимагають захисту або ці функціональні групи в бічному ланцюзі мають захисні групи, які стабільні до кислотних або лужних реагентів, що використовуються для зняття захисту відповідно Вос і Fmoc;

(Г) зняття захисту Вос з «блокованого продукту наступного приєднання», що включає проведення реакції цього «блокованого продукту наступного приєднання» з кислотою з одержанням «деблокувати продукту наступного приєднання»;

(Д) на розсуд, повторення етапів (в) і (г), причому в кожному циклі утворюється «деблокувати продукт (Х + 1) -го наступного приєднання», де Х позначає число бажаних повторень циклів;

(Е) приєднання «наступної амінокислоти» до «деблокувати продукту першого приєднання» з етапу (б) або, на розсуд, до «деблокувати продукту (Х + 1) -го наступного приєднання» з етапу (д), що включає проведення реакції « наступного амінокислоти »із зазначеним« деблокувати продуктом першого приєднання »або із зазначеним« деблокувати продуктом (Х + 1) -го наступного приєднання »в органічному розчиннику, що містить реагент для нарощування пептиду з одержанням« блокованого продукту наступного приєднання », причому ця« наступна амінокислота »має блокований Fmoc аминогруппу основному ланцюзі, за умови, що якщо ця« наступна амінокислота »має одну або кілька функціональних груп в бічному ланцюзі, тоді функціональні групи в бічному ланцюзі не вимагають захисту або функціональні групи в бічному ланцюзі мають захисні групи, які стійкі до лужним реагентів, що використовуються для зняття захисту Fmoc;

(Ж) зняття захисту Fmoc з «блокованого продукту наступного приєднання», що включає проведення реакції «блокованого продукту наступного приєднання» з первинним або вторинним аміном, щоб отримати «деблокувати продукт наступного приєднання»;

(З) на розсуд, повторення етапів (е) і (ж), причому в кожному циклі утворюється «деблокувати продукт (Х + 1) -го наступного приєднання», де Х - бажане число повторень циклу, поки не будуть включена в пептид і деблокувати передостання амінокислота;

(І) приєднання N-кінцевої амінокислоти до «деблокувати продукту (Х + 1) -го наступного приєднання», що включає проведення реакції N-кінцевої амінокислоти з «деблокувати продуктом (Х + 1) -го наступного приєднання» в органічному розчиннику, що містить реагент для нарощування пептиду, з отриманням «блокованого продукту завершеного приєднання», де «N-кінцева амінокислота» має аминогруппу основному ланцюзі, блокований Вос або Fmoc;

(Й) зняття захисних груп Вос або Fmoc з «блокованого продукту завершеного приєднання», що включає проведення реакції «блокованого продукту завершеного приєднання» з кислотою в разі Вос або з основою в разі Fmoc, з утворенням завершеного пептидного продукту на смолі;

(К) якщо на «завершеному пептидному продукті на смолі» є функціональні групи бічних ланцюгів, тоді, на розсуд, зняття захисту функціональних груп бічних ланцюгів «завершеного пептидного продукту на смолі», що включає проведення реакції «завершеного пептидного продукту на смолі» з відповідними знімають захист реагентами з отриманням «завершеного пептидного продукту на смолі зі знятою захистом»; і

(Л) відщеплення пептиду від твердого носія смоли в складі «завершеного пептидного продукту на смолі» або «завершеного пептидного продукту на смолі зі знятою захистом» з отриманням пептиду, що включає проведення реакції «завершеного пептидного продукту на смолі» або «завершеного пептидного продукту на смолі зі знятою захистом »з аміаком, первинним аміном або вторинним аміном до практичного завершення відщеплення пептиду від смоли;

за умови, що етапи (е) і (ж) в синтезі пептиду здійснюють шість разів після утворення «деблокувати продукту першого приєднання» формули HL-Thr-смола, де наступні амінокислоти приєднуються в порядку: Fmoc-L-Cys (Acm), Fmoc -L-Val, Fmoc-L-Lys (Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr (Ot-Bu) і Fmoc-L-Cys (Acm) з утворенням продукту H-Cys (Acm) -Tyr (Ot-Bu) -D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys (Acm) -Thr-смола.

2. Спосіб згідно п.1, де аміак, первинний амін або вторинний амін в етапі (л) знаходяться в розчиннику, що містить спирт і, на розсуд, апротонний полярний розчинник.

3. Спосіб згідно п.1, де етап (л) додатково включає наступні стадії:

(I) осадження відщеплення пептиду з розчинника;

(Ii) відділення фільтруванням твердого носія смоли і обложеного пептиду і

(Iii) екстрагування пептиду кислотним розчином для виділення пептиду.

4. Спосіб за будь-яким з пп.1-3, де перша амінокислота є цезієві сіль Boc-L-Thr, що дає в якості продукту першого приєднання Boc-L-Thr-смолу, а «деблокувати продуктом першого приєднання» є HL-Thr -смола.

5. Спосіб згідно п.4, де кислотою, використовуваної для видалення захисної групи Вос в етапі (й), є трифтороцтова кислота (ТФУ).

6. Спосіб згідно п.5, де органічним розчинником є ​​метилен-хлорид, хлороформ або диметилформамід, а реагентом для нарощування пептиду є діізопропіл-карбодиїмідів, діціклогексіл-карбодиїмідів або N-етил-N "- (3-диметил-амінопропіл) карбодиїмідів.

7. Спосіб згідно п.6, що включає приєднання Boc-D- -Nal до H-Cys (Acm) -Tyr (Ot-Bu) -D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys (Acm) -Thr-смолі згідно етапу (і) з отриманням Boc-D- -Nal-Cys (Acm) -Tyr (Ot-Bu) -D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys (Acm) -Thr-смоли.

8. Спосіб згідно п.7, що включає одночасне зняття групи Вос, яка блокує D- -Nal, групи Ot-Bu, що захищає Тyr, і групи Воc, що захищає Lys в Boc-D- -Nal-Cys (Acm) -Tyr (Ot -Bu) -D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys (Acm) -Thr-смолі, згідно етапу (й) з отриманням завершеного пептидного продукту на смолі формули HD- -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D -Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-смола.

9. Спосіб згідно п.8, що включає відщеплення пептиду HD- -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr від твердої смоли шляхом проведення реакції HD- -Nal-Cys ( Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-смоли з аміаком в розчиннику, що містить спирт і, на розсуд, апротонний полярний розчинник, до в основному повного відщеплення з отриманням HD- -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-NH 2.

10. Спосіб згідно п.9, де спиртом є метанол, а полярний апротонний розчинник - це диметилформамид.

11. Спосіб згідно п.10, що включає одночасне видалення груп Асm, що захищають Cys, і циклізація виходять залишків Cys зі знятою захистом в «завершеному пептидному продукті на смолі» формули HD- -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp- Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-NH 2 шляхом проведення реакції HD- -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-NH 2 з розчином йоду в спирті до в основному повних зняття захисту і циклізації з одержанням HD- -Nal - Thr-NH 2.

Твердофазний синтез заснований на тому, що перша ланка майбутнього олигомера ковалентно закріплюється на "якірної" групі Н., нарощування ланцюга проводиться стандартно захищеними мономерами за звичайними схемами, використовуваним для синтезу в розчинах. На укладе. етапі синтезується. олигомер отщепляется від Н. і очищається відповідними методами. Твердофазний синтез застосовують в осн. для отримання поліпептидів, оліго- нуклеотидів і олігосахаридів.

При синтезі поліпептидів в якості Н. наиб. широко використовують сополімер стиролу і 1-2% дивинилбензола, модифікований введенням діметоксібензілхлорідной якірної групи для приєднання першої амінокислоти (з захищеною групою N H 2) по С-кінця, напр .:

Після видалення N-захисної групи нарощування поліпептидного ланцюга проводять стандартними методами пептидного синтезу в розчині (див. Пептиди). Як конденсують агентів наиб. часто використовують карбодиїмідів або попередньо перетворюють амінокислоти в активир. ефіри.

При синтезі олігонуклеотидів як Н. використовують макропористі скла або силікагель. Якірної групою служить карбоксильная група, відокремлена від пов-сті Н. спец. "Ніжкою", напр .:

По-пуриновое або пірімідіковое підставу

На першій стадії нуклеозид приєднують до носія по 3 "-гідроксільной групі дезоксирибози, у до-рій гідроокис-сильна група в положенні 5" захищена діметоксітрі-тільной групою (СН 3 ОС 6 Н 4) 2 (С 6 Н 5) С (DMTr ); кол-во останньої після її відщеплення легко вимірюється спектро-фотометричним, що служить кількостей. характеристикою завантаження носія і дозволяє оцінити виходи на наступних стадіях нарощування олігонуклеотидних ланцюга. Після видалення групи DMTr збірку ланцюга здійснюють за допомогою фосфітамідов (ф-ла I; M. Kapoзерс, 1980) або фосфонатов (гідрофосфонатов) (II; Р. Стремберг, 1986):

Для здійснення твердофазного синтезу необхідні високі виходи (на рівні 96-99%) на кожній стадії р-ції, а також ефективні методиочищення і виділення синтезується. з'єднань.

Використання твердої фази дозволяє істотно спростити і прискорити проведення кожної стадії нарощування ланцюга олігомеру, оскільки відділення надлишку компонентів, конденсують агентів і побічних продуктів, що знаходяться в розчині, досягається фільтруванням реакц. суміші та відмиванням Н. відповідним набором р-рите-лей. Т. обр., Процес складання ланцюга олігомеру розпадається на ряд стандартних операцій: деблокування зростаючого кінця ланцюга, дозування чергового захищеного мономера і конденсується агента, подача цієї суміші на колонку з Н. протягом розрахованого часу і відмивання Н. відповідним р-телеглядачам. Цикл нарощування мономерного ланки м. Б. автоматизований.

В основі автоматичним. пром. синтезаторів лежить загальна принципова схема (див. рис.). Багаточисельних. моделі синтезаторів різняться конструкцією колонок і їх кол-вом, способом подачі реагентів і р-телеглядачам і ін. Управління і програмування здійснюють за допомогою вбудованого або винесеного комп'ютера.

Принципова схема пристрою автоматичним. пром. синтезаторів (елект. лінія управління позначена пунктиром): 1 -лінія подачі мономерів (М 1, М n) і конденсується агента (КА); 2-лінія подачі реагентів (напр., Окислювачів, ацілірующіх агентів, к-т та ін.) І р-телеглядачам (P 1, Р n); 3 - переключають клапани; 4-колонка з носієм, забезпечена розподілить. клапаном; 5-фотометріч. комірка; 6-вимірювач; 7-блок управління і програмування; 8-дисплей.

Потенційні можливості твердофазного синтезу були продемонстровані синтезом рибонуклеази А (Р. Мерріфілд, 1969) і гормону росту людини (Д. Ямашіро, 1970) довжиною 124 і 183 амінокислоти відповідно. Однак у зв'язку з невеликою, але постійної рацемізації, яка відбувається при утворенні пептидного зв'язку, синтезуються. білки мають низьку біол. активністю, тому автоматичним. синтезатори використовуються гл. обр. для отримання коротких поліпептидів (10-30 ланок), в т. ч. для препаратівного