ВЕРХ мс що. Застосування тандемноймасс-спектрометрії (ВЕРХ-МСМС) в клінічній діагностиці. матеріали та методи

1

Для ідентифікації та кількісного визначення нового амінокислотного похідного 1,3,4-тіадіазол ЛХТ7-09 був розроблений валідований метод ВЕРХ-МС / МС. Максимальна чутливість мас-спектрометричного детектування ЛХТ7-09 була досягнута в режимі реєстрації позитивних іонів при напрузі електроспрея 5500 В і потенціал декластерізаціі 36 В. Виявлення MRM-переходи підтвердили хімічну структуру нового амінокислотного похідного 1,3,4-тіадіазол. Для ефективного виділення ЛХТ7-09 з багатокомпонентних сумішей тіадіазоліламідов розроблений градієнтний режим високоефективної рідинної хроматографії з використанням як елюент суміші ацетонітрилу і деионизированной води в різних співвідношеннях. Для даних умов хроматографії визначено час утримування з'єднання ЛХТ7-09, рівне 11 хвилинам. Для кількісного визначення сполуки ЛХТ7-09 розроблено Градуювальне рішення залежно площі хроматографічного піку від концентрації розчину.

вЕРХ-мс / мс

хроматографія

мас-спектрометрії

тіадіазол

1. Казаїшвілі Ю.Г., Попов Н.С. Дослідження протизапальних активності нових похідних тіадіазол при формалінових набряку лапи у щурів / Ю.Г. Казаїшвілі, Н.С. Попов // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2013. - № 3. www ..

2. Нові похідні тіадіазол, що володіють протигрибкову активність / А.С. Кошевенко [и др.] // Успіхи медичної мікології. - 2015. - Т. 14. - С. 348-351.

3. Синтез і протипухлинна активність нових фурил-2-заміщених 1,3,4-тіадіазол, 1,2,4-триазолів / Т.Р. Овсепян [и др.] // Хіміко-фармацевтичний журнал. - 2011.- Т. 45. - № 12. - С. 3-7.

4. Попов Н.С., Демидова М.А. Оцінка гострої токсичності нового амінокислотного похідного тіадіазол при введенні мишам / Н.С. Попов, М.А. Демидова // Верхневолжскій медичний журнал. - 2016. - Т. 15, вип. 1. - С. 9-12.

5. Попов Н.С., Демидова М.А. Оцінка ульцерогенності нового амінокислотного похідного тіадіазол при внутрішньошлунковому введенні щурам / Н.С. Попов, М.А. Демидова // Лікар-аспірант. - 2017. - № 1 (80). - С. 71-78.

6. Синтез та протимікробна активність амідів фенілтіо- і бензілсульфонілуксусних кислот на основі 2-аміно-5-алкіл (арилалкіл) -1,3,4-тіадіазол / С.А. Сєрков [и др.] // Хіміко-фармацевтичний журнал. - 2014. - Т. 48, № 1. - С. 24-25.

7. Arpit K., Basavaraj M., Sarala P., Sujeet K., Satyaprakash K. Synthesis and pharmacological activity of imidazothiadiazole derivatives // Acta Poloniae Pharmaceutica, Drug Research. 2016. Vol. 73. No. 4. P. 937-947.

8. Eman M. Flefel, Wael A. El-Sayed, Ashraf M. Mohamed Synthesis and Anticancer Activity of New 1-Thia-4-azaspirodecane, Their Derived Thiazolopyrimidine and 1,3,4-Thiadiazole Thioglycosides // Molecules. 2017. No. 22 (1). P. 170.

9. Jorge R.A. Diaz, Gerardo Enrique Cami. Salts of 5-amino-2-sulfonamide-1,3,4-thiadiazole, a structural and analog of acetazolamide, show interesting carbonic anhydrase inhibitory properties, diuretic, and anticonvulsant action // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2016. Vol. 12. No. 6. P. 1102-1110.

10. Naiyuan Chen, Wengui D., Guishan L., Luzhi L. Synthesis and antifungal activity of dehydroabietic acid-based 1,3,4-thiadiazole-thiazolidinone compounds // Molecular Diversity. 2016. Vol. 20. No. 4. P. 897-905.

11. Yomna, I. El-Gazzar, Hanan H. Georgey, Shahenda M. El-Messery. Synthesis, biological evaluation and molecular modeling study of new (1,2,4-triazole or 1,3,4-thiadiazole) -methylthio-derivatives of quinazolin-4 (3H) -one as DHFR inhibitors // Bioorganic Chemistry. 2017. Vol. 72. P. 282-292.

Високоефективна рідинна хроматографія з мас-спектрометричним детектуванням є одним з найбільш перспективних методів для ідентифікації та кількісного визначення лікарських речовин в різних біологічних об'єктах. Метод відрізняється високою специфічністю, точністю і можливістю визначення речовин в мінімальних концентраціях, що дозволяє використовувати його для кількісного визначення лікарських речовин при проведенні фармакокінетичних досліджень і лікарського моніторингу, що є значущим для клінічної лабораторної діагностики. З цією метою необхідно розробити та валідація методик кількісного визначення різних лікарських речовин, в тому числі інноваційних, на основі ВЕРХ-МС / МС-методу.

Оригінальним лікарською речовиною з групи нестероїдних протизапальних засобів є ацексазоламід - нове похідне аміду 1,3,4-тіадіазол і ацексамовой кислоти. Істотною перевагою даного з'єднання є невисока токсичність і низька ульцерогенність. Для проведення фармакокінетичних досліджень і оцінки біодоступності даного лікарського речовини при різних шляхах введення необхідна розробка надійної методики його кількісного визначення в біологічних рідинах.

Метою цього дослідження є розробка методики ідентифікації та кількісного визначення нового нестероїдного протизапального засобу з групи похідних тіадіазол за допомогою ВЕРХ-МС / МС.

матеріали та методи

Об'єктом дослідження було нове похідне тіадіазол з лабораторним шифром ЛХТ 7-09, синтезоване в ВАТ «ВНЦ БАВ» (м Стара Купавна) проф. С.Я. Скачіловой (рис. 1).

2- (5-етил-1,3,4-тіадіазол) амід 2-ацетіламіногексановой кислоти

Мал. 1. Хімічна структура ЛХТ 7-09 (брутто формула: З 12 Н 20N 4 О 2S; молярна маса 284,4г / моль)

З'єднання ЛХТ 7-09 за зовнішнім виглядом являє собою порошок білого кольору, Який практично не розчинний у воді, розчинний у спирті, легко розчинний в ацетонітрилі.

Для ідентифікації та кількісного визначення ЛХТ 7-09 використовували валідований метод високоефективної рідинної хроматографії з мас-спектрометричним детектуванням (ВЕРХ-МС / МС).

Хроматографію здійснювали за допомогою високоефективного рідинного хроматографаAgilent 1260 InfinityII (AgilentTechnologies, ФРН). У дослідженні використовували аналітичну колонку AgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 мкм 2,1 × 10 мм. Для виділення досліджуваного з'єднання нами був розроблений градієнтний режим хроматографії. Як елюента застосовували ацетонитрил, воду деіонізовану і амонію ацетат в різних співвідношеннях.

Для мас-спектрометрії використовували потрійний квадрупольний мас-спектрометр ABSciexQTrap 3200 MD (ABSciex, Сінгапур) з електрораспилітельним джерелом іонів (TurboV з зондом TurboIonSpray). Калібрування мас-спектрометра проводили за допомогою тестового розчину резерпіну в концентрації 6,1 × 10 -2 мг / л.

Мас-спектрометричний аналіз досліджуваних зразків проводили в режимі електрораспиленія при прямому введенні зразка і елюата, що подається хроматографом. Пряме введення досліджуваних зразків в мас-хроматограф здійснювали за допомогою шприцевого насоса діаметром 4,61 мм зі швидкістю 10 мкл / хв.

При розробці методики ідентифікації та кількісного визначення нового похідного тіадіазол підбирали оптимальні умови високоефективної рідинної хроматографії і мас-детектування. Брали до уваги час виходу речовини з хроматографічної колонки і MRM-перехід (здійснювали реєстрацію m/ z іона-попередника на першому аналітичному квадруполів Q1 і m/ z іонів-продуктів на другому аналітичному квадруполів Q3). Для кількісного визначення ЛХТ 7-09 проводили побудова калібрувального графіка в діапазоні концентрацій від 0,397 до 397 нг / мл.

Як програмне забезпечення використовували AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex).

Результати та обговорення

На першому етапі експериментального дослідження здійснювали мас-детектування досліджуваного зразка шляхом його прямого введення в мас-детектор за допомогою шприцевого насоса. На етапі пробопідготовки отримували розчин ЛХТ 7-09 (500 нг / мл) в суміші ацетонітрилу і води іонізованої в співвідношенні 2: 1 з додаванням амонію ацетату (0,1%).

Попередні експерименти показали, що в режимі реєстрації позитивних іонів чутливість визначення ЛХТ 7-09 була вище, а мас-спектр інтенсивніше і інформативніше, ніж в режимі реєстрації негативних іонів. У зв'язку з цим в подальших дослідженнях використовували тільки режим позитивної іонізації.

Для отримання інтенсивного піку були підібрані наступні умови мас-детектування : позитивна поляризація, напруга електроспрея 5500,0 В, потенціал декластерізаціі і потенціал введення - відповідно 36,0 і 6,5 В при тиску газу завіси 20,0 psi і газу розпилення 40,0 psi, швидкість 10 мкл / хв. Діапазон сканування становив 270-300 Да.

Аналіз отриманого мас-Спектрал першому аналітичному квадруполів Q1 показав, що в даних умовах за рахунок приєднання протона водню утворюється протонированная молекула дослідженого з'єднання + зі значенням m/ z285,2 Да (рис. 2).

Мал. 2. Мас-спектр протоновану молекули ЛХТ 7-09 (в режимі сканування позитивних іонів +)

На другому аналітичному квадруполів Q3 здійснювали реєстрацію іонів-продуктів для іона-попередника зі значенням m / z285,2 Да. Аналіз мас-спектра 2 порядки показав наявність безлічі піків, з яких 3 були найбільш інтенсивними - m / z 114,2 Дa, m / z 130,2 Та й m / z 75,1 Дa (рис. 3).

Мал. 3. Мас-спектр іонів-продуктів (в режимі сканування позитивних іонів, іон-попередникm/ z 285,2 Да)

Для отримання іонного сигналу високої інтенсивності були підібрані оптимальні значення енергії в осередку зіткнення Q2 (розглянутий діапазон енергій від 0 до 400 В). Для іонів-продуктів зі значеннями m/ z114,2 Дa, 130,2 Та й 75,1 Дaоптімальная енергія в соударітельной осередку склала відповідно 27 В; 23 В і 49 В.

Передбачається, що іон-продукт зі значенням m/ z114,2 Дa є фрагментом 5-аміно-2-етил-1,3,4-тіадіазол, так як при фрагментації інших похідних 1,3,4-тіадіазол також виявляється іон-продукт з таким же значенням m/ z. Іон-продукт зі значенням m/ z 130,2 Та, ймовірно, є протоновану фрагментом ацексамовой кислоти. Таким чином, результати проведеного мас-детектування досліджуваного зразка підтвердили хімічну структуру нового похідного 1,3,4-тіадіазол.

На наступному етапі експериментального дослідження здійснювали аналіз досліджуваного з'єднання методом ВЕРХ-мас-спектрометрії.

У режимі ВЕРХ-МС / МС використовували такі умови іонізації: напруга електроспрея 5500,0 В, швидкість потоку рухомої фази 400 мкл / хв, температура азоту 400 ° С, тиск газу завіси і розпилювального потоку 20,0 і 50,0 psi відповідно. Швидкість реєстрації одиничних мас-спектрів склала 100 спектрів в секунду. Для отримання підсумованого мас-спектра на хроматограмі виділяли часовий проміжок 10,5-11,5 хв; за інтенсивністю сигналу іонів-продуктів будували криві тимчасової залежності іонного струму і площі піків окремих сигналів, відповідних досліджуваного з'єднанню. Обсяг введеної проби в аналітичну колонку склав 10 мкл.

Для виділення досліджуваного з'єднання був використаний градієнтний режим високоефективної рідинної хроматографії, який забезпечувався зміною складу елюента на вході в аналітичну колонку. Як елюента застосовували ацетонитрил, воду деіонізовану і амонію ацетат в різних співвідношеннях. Вибір градієнтного режиму хроматографії був пов'язаний з тим, що в умовах ізократіческого режиму елюювання (в тому числі при використанні різних концентрацій ацетонітрилу) не вдавалося отримати пік досліджуваного речовини симетричної форми з придатним для аналізу часом утримування. За даними проведеного дослідження оптимальним був наступний режим подачі елюента: з 0 до 4 хв концентрація ацетонітрилу 1%; з 4 по 8 хв лінійне збільшення концентрації ацетонітрилу до 99%; з 8 по 12 хвилину - ізократіческій ділянку (1% ацетонітрилу). По завершенні дослідження здійснювали промивку хроматографічної колонки 30% розчином ацетонітрилу протягом 5 хвилин.

При використанні описаного режиму хроматографії для дослідженого з'єднання було отримано симетричний пік достатньої інтенсивності (рис. 4).

Мал. 4. Хроматограмма ЛХТ 7-09 (аналітична колонкаAgilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 мкм 2,1 × 10 мм; градієнтний режим хроматографії)

Аналіз отриманих хроматограм для розчинів ЛХТ 7-09 різної концентрації показав, що час утримування (tR) за даних умов елюювання склало 11 хвилин і не залежало від концентрації досліджуваної речовини. У зв'язку з цим значення часу утримування можна використовувати в якості додаткового критерію підтвердження автентичності ЛХТ 7-09 в складі багатокомпонентних сумішей. Звертає на себе увагу той факт, що дані параметри хроматографії можна використовувати для ідентифікації ЛХТ 7-09 не тільки за допомогою мас-детектора, а й інших детекторів, в тому числі фотометрического.

Для кількісного визначення нового похідного тіадіазол здійснювали побудова калібрувального графіка в діапазоні концентрацій від 0,397 нг / мл до 397 нг / мл (рис. 5).

Мал. 5. Калібрувальний графік для визначення концентрацііЛХТ 7-09 (по осі абсцис - концентрація ЛХТ 7-09 в нг / мл, по осі ординат - площа піку в імпульсах)

Для розробки градуировочного рішення використовували розчини ЛХТ 7-09 в концентраціях 0,397; 1,980; 3,970; 19,8; 39,7; 198,0; 397,0 нг / мл. Залежність площі піку від концентрації дослідженого з'єднання описувалося наступним рівнянням регресії:

y \u003d 8,9e 5 · x 0,499, значення коефіцієнта регресії склало r \u003d 0,9936.

Слід зазначити, що розроблене Градуювальне рішення дозволяє з високою точністю здійснювати кількісне визначення дослідженого з'єднання в широкому діапазоні концентрацій, що дозволяє використовувати даний метод для оцінки якості лікарського речовини і для проведення фармакокінетичних досліджень.

Таким чином, результатом проведеного дослідження є розробка методу ідентифікації і кількісного визначення нового амінокислотного похідного тіадіазол за допомогою ВЕРХ-МС / МС.

висновки

1. ВЕРХ-МС / МС дозволяє з високою точністю здійснювати ідентифікацію та кількісне визначення нового амінокислотного похідного тіадіазол.
2. Мас-детектування нового похідного тіадіазол ЛХТ 7-09 доцільно проводити в режимі сканування позитивних іонів (МRM-перехід - іон-попередник Q1 m/ z285,2 Та; іони-продукти Q3 m/ z 114,2 Дa, m/ z 130,2 Та й m/ z 75,1 Дa).
3. Для виділення ЛХТ 7-09 з багатокомпонентних сумішей розроблена методика високоефективної рідинної хроматографії (аналітична колонка Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 мкм 2,1 × 10 мм; елюент ацетонитрил: вода деіонізована: амонію ацетат; градієнтний режим).

бібліографічна посилання

Попов Н.С., Малигін А.С., Демидова М.А. РОЗРОБКА ВЕРХ-МС / МС-МЕТОДУ ДЛЯ ІДЕНТИФІКАЦІЇ І КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ НОВОГО ПОХІДНОГО тіадіазол // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2017. - № 5 .;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id\u003d26988 (дата звернення: 01.02.2020). Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»

Ключові слова

Стероїди / ЛІПІДИ / СИРОВАТКА КРОВІ / МЕТАБОЛІЧНИЙ ПРОФІЛЬ / ПРОМИСЛОВІ ВІДХОДИ / STEROIDS / LIPIDS / BLOOD SERUM / METABOLIC PROFILE / INDUSTRIAL WASTES

анотація наукової статті по ветеринарним наук, автор наукової роботи - Чаховскій Павло Анатолійович, Янцевіч Олексій Вікторович, Дмитроченко Алеся Єгорівна, Іванчик Олександр Вікторович

вплив антропогенних факторів робить багатобічна вплив на організм людини і тварин. У зв'язку з їх комплексним впливом виявлення негативних ефектів окремих факторів є досить складне завдання. Метаболомная методологія, що дозволяє подолати зазначені труднощі, була застосована при оцінці характеру і ступеня впливу відходів виробництва калійних добрив на ліпідні профілі експериментальних тварин при интраназальной затравки відходами виробництва калійних добрив і споживанні питної води, Отриманої з джерел, розташованих в зоні потенційного дії калійного виробництва. Виділення ліпідів з сироватки проводили за допомогою спеціально розробленої методики, заснованої на твердофазной екстракції, що дозволяє видалити з зразків холестерин. Кожен зразок був підданий аналізу методом високоефективної рідинної хроматографії з мас-спектрометрической детекцией (ВЕРХ-МС), після чого отримані хроматограми обробляли з використанням методу головних компонент (МГК) і кластерного аналізу. Розроблена методика дозволяє ефективно розділяти гідрофобні метаболіти в сироватці крові. Встановлено ліпідний профіль сироватки крові дослідних тварин, зокрема вміст фосфоліпідів і оксістероідов, і виявлені відмінності в метаболічних процесах між досвідченими і контрольними тваринами. У сироватці крові експериментальних тварин була підвищена в порівнянні з контрольною групою концентрація оксістероідов.

Схожі теми наукових робіт з ветеринарним наук, автор наукової роботи - Чаховскій Павло Анатолійович, Янцевіч Олексій Вікторович, Дмитроченко Алеся Єгорівна, Іванчик Олександр Вікторович

• Реакція органел гепатоцитів печінки щурів на вплив амплітудно-модульованого магнітного поля промислової частоти

  2014 / Бєлкін Анатолій Дмитрович, Мічуріна Світлана Вікторівна

• Мас-селективна ідентифікація гормональних препаратів в м'ясній сировині. Аналіз ß-агоністів

  2016 / Куликівський А.В., Кузнєцова О.А., Иванкин А.Н.

• Застосування високоефективної рідинної хроматографії для визначення убихинона в гідробіонтах

  2003 / Рибін В. Г.

• Визначення N7 - етил] -гуаніну в сечі щурів як маркера впливу сірчистого іприту

  2017 / Орлова Ольга Ігорівна, Каракаш Георгій Васильович, Шмурак Володимир Ігорович, Абзіанідзе Вікторія Володимирівна, Савельєва Олена Ігорівна

• Розробка ВЕРХ-МС-методу для аналізу урсодезоксихолевої кислоти в режимі реєстрації позитивно заряджених іонів

  2013 / Краснов Ілля Олександрович, Бобков Д. Є., Зайцева М., Прісяч С. С., Краснов Н. В.

• Розробка технології створення тест-систем нового покоління на основі тромбодефенсінов для експрес-діагностики інфекційно-запальних захворювань

  2015 / Іванов Юрій Борисович, Васильченко Олексій Сергійович

• Методика одночасного визначення карбамазепіну і карбамазепін-10,11-епоксиду методом ВЕРХ-МС / мс

  2015 / Батьківщина Т.А., Мельников Є.С., Соколов А.В., Прокоф'єв А.Б., Архипов В.В., Адамов Г.В., Поздняков Д.Л., Олефір Ю.В.

• Склад жирних кислот і стероїдів рослинних масел

  2006 / Хасанов В. В., Рижова Г. Л., Дичко К. А., Куряева Т. Т.

• Розробка та валідація методу визначення гідазепаму в біолгіческом матеріалі методом хроматомасспектрометріі

  2015 / А.В. Чубенко, М.А. Савченко

• Визначення циклоспорину а в сироватці крові для терапевтичного лікарського моніторингу

  2008 / Федорова Г. А., Подольська Є. П., Новіков А. В., Лютвінскій Я. І., Краснов Н. В.

ANALYSIS OF SERUM LIPID PROFILES IN GUINEA PIGS FOR EARLY DETECTION OF CHANGES IN METABOLISM UNDER EXPOSURE TO ENVIRONMENTAL CONTAMINANTS

The exposure to anthropogenic factors has a multifaceted impact on the body of humans and animals. Due to their complex influence the detection of negative effects of the certain factors is a rather complicated task. Metabolomic methodology which permits to overcome these difficulties, has been applied in the evaluation of the nature and degree of the impact of potash fertilizers production waste on lipid profiles of experimental animals after intranasal inoculation with potassic fertilizer production waste and consumption of drinking water obtained from sources located in the zone of potential action of potassic fertilizer production. Isolation of lipids from serum was performed with the help of specially developed technique based on solid-phase extraction of samples which allows to remove cholesterin from the samples. Each sample was subjected to HPLC-MS analysis, after which the obtained chromatograms were treated with the use of the method of principal component analysis and cluster analysis. The developed technique allows to efficiently separate hydrophobic metabolites in blood serum. There was established serum lipid profile of experimental animals, in particular the content of phospholipids and oxysteroids, and there were found differences in the metabolic processes of the test and control animals. It is shown that in the serum of experimental animals, there is observed an increased concentration of hydroxysteroid as compared with the control group ,.

Текст наукової роботи на тему «ВЕРХ-мс-методика аналізу ліпідних профілів сироватки крові морських свинок для виявлення ранніх змін метаболізму при впливі забруднювачів навколишнього середовища»

[Гієна і санітарія 3/2014

Чаховскій П.А.1, Янцевіч А.В.2, Дмитроченко А.Е.2, Іванчик А.В.2

ВЕРХ-МС-МЕТОДИКА АНАЛІЗУ ЛІПІДНИХ ПРОФІЛЕЙ СИРОВАТКИ КРОВІ

морських свинок для виявлення ранніх змін метаболізму при впливі забруднювачів навколишнього середовища

ТУ «Республіканський науково-практичний центр гігієни», 220012, м.Мінськ, Республіка Білорусь; ^ Інститут біоорганічної хімії Національної академії наук Білорусі, 220141, м.Мінськ, Республіка Білорусь

Вплив антропогенних факторів робить багатобічна вплив на організм людини і тварин. У зв'язку з їх комплексним впливом виявлення негативних ефектів окремих факторів являє собою досить складну задачу. Метаболомная методологія, що дозволяє подолати зазначені труднощі, була застосована при оцінці характеру і ступеня впливу відходів виробництва калійних добрив на ліпідні профілі експериментальних тварин при интраназальной затравки відходами виробництва калійних добрив і споживанні питної води, отриманої з джерел, розташованих в зоні потенційного дії калійного виробництва. Виділення ліпідів з сироватки проводили за допомогою спеціально розробленої методики, заснованої на твердофазной екстракції, що дозволяє видалити з зразків холестерин. Кожен зразок був підданий аналізу методом високоефективної рідинної хроматографії з мас-спектрометрической детекцией (ВЕРХ-МС), після чого отримані хроматограми обробляли з використанням методу головних компонент (МГК) і кластерного аналізу. Розроблена методика дозволяє ефективно розділяти гідрофобні метаболіти в сироватці крові. Встановлено ліпідний профіль сироватки крові дослідних тварин, зокрема вміст фосфоліпідів і оксісте-роідов, і виявлені відмінності в метаболічних процесах між досвідченими і контрольними тваринами. У сироватці крові експериментальних тварин була підвищена в порівнянні з контрольною групою концентрація оксістероідов.

Ключові слова: стероїди; ліпіди; сироватка крові; метаболічний профіль; промислові відходи.

P. A. Chakhovskiy1, A.V Yantsevich2, A. E. Dmitrochenko2, A. V. Ivanchik2 - ANALYSIS OF SERUM LIPID PROFILES IN GUINEA PIGS FOR EARLY DETECTION OF CHANGES IN METABOLISM UNDER EXPOSURE TO ENVIRONMENTAL CONTAMINANTS

1The Republican Scientific and Practical Centre of Hygiene, Minsk, Republic of Belarus, 220012; 2The Institute of Bioorganic Chemistry, Minsk, Republic of Belarus, 220141

для кореспонденції: Чаховскій Павло Анатолійович, [Email protected] . com

The exposure to anthropogenic factors has a multifaceted impact on the body of humans and animals. Due to their complex influence the detection of negative effects of the certain factors is a rather complicated task. Metabolomic methodology which permits to overcome these difficulties, has been applied in the evaluation of the nature and degree of the impact of potash fertilizers production waste on lipid profiles of experimental animals after intranasal inoculation with potassic fertilizer production waste and consumption of drinking water obtainedfrom sources located in the zone ofpotential action ofpotassic fertilizer production. Isolation of lipids from serum was performed with the help of specially developed technique based on solid-phase extraction of samples which allows to remove cholesterin from the samples. Each sample was subjected to HPLC -MS analysis, after which the obtained chromatograms were treated with the use of the method of principal component analysis and cluster analysis. The developed technique allows to efficiently separate hydrophobic metabolites in blood serum. There was established serum lipid profile of experimental animals, in particular the content of phospholipids and oxysteroids, and there were found differences in the metabolic processes of the test and control animals. It is shown that in the serum of experimental animals, there is observed an increased concentration of hydroxysteroid as compared with the control group ,.

Key words: steroids, lipids, blood serum, metabolic profile, industrial wastes.

Вступ

Одна з найважливіших завдань системної біології і функціональної генетики - інтегрування даних протеоміки, транскріптомікі та інформації про метаболічних процесах, що відбуваються в організмі. Будь-яке захворювання або патологічний процес, що протікає в організмі, відбивається на утриманні низькомолекулярних метаболітів в тканинах і крові. Для інтегральної характеристики низькомолекулярних метаболітів плазми крові в 1971 р було введено термін «метаболічний профіль». Оскільки одночасний аналіз кількох класів метаболітів надзвичайно складний і практично не реалізовується, для вивчення метаболічних профілів зазвичай використовують серію методів, включаючи ядерномагнітний-резонансну (ЯМР) спектроскопію з високою роздільною здатністю і хромато-мас-спектрометрії.

Як правило, при проведенні метаболомних досліджень обмежуються певною групою речовин, відокремлюваних від інших компонентів при пробопідготовці. Отримувані при цьому групові дані легше інтерпретувати.

Метаболічні профілі (зокрема, сечі і плазми крові) можуть бути використані для визначення характеру фізіологічних змін, викликаних надходженням в організм токсичних сполук. У багатьох випадках спостерігаються зміни можуть дати додаткову характеристику специфічних поразок, наприклад печінки і жирової тканини.

Аналіз змісту стероїдів і ліпідів в сироватці крові має великий діагностичним потенціалом. Ліпідний склад сироватки крові, стероїдні гормони, їх попередники і продукти їх метаболічних перетворень характеризують безліч функціональних параметрів організму. Ці речовини відіграють важливу координуючу роль в регуляції метаболізму і серцево-судинної функції, беруть участь у відповіді організму на гострий і хронічний стрес.

Стероїдний профіль є унікальним діагностичним критерієм ряду гінекологічних та онкологічних захворювань, пов'язаних з порушенням синтезу і метаболізму стероїдних гормонів, При цьому деякі з них можуть бути діагностовані тільки по стероидному профілем. У профільному аналізі досить значима можливість використання абсолютних величин як простих змінних і порівняння їх з нормою. Однак зміна співвідношення величин може бути більш важливим. Крім того, стероїдний профіль дає інформацію про велику кількість стероїдів одночасно.

Визначення стероїдного профілю сироватки крові - ефективний метод виявлення майже всіх порушень метаболізму стероїдів, який дозволяє поставити

точний діагноз у багатьох клінічних ситуаціях, наприклад при вродженої гіперплазії кори надниркових залоз, гиперальдостеронизме I типу, первинному гіперальдостеронізм, хвороби Іценко-Кушинга, недостатності надниркових залоз та ін. Стероїдний профіль важливий при діагностиці порушень статевої діфферен-цировки і функції статевих залоз, а також гіпоталамо гіпофізарно-надниркової недостатності.

Надмірне надходження солі, що є переважаючим компонентом відходів калійних добрив, в організм експериментальних щурів з надмірною масою тіла призводить до зайвої активації синтезу Альдо-стерону і викликає гіпертензію та ураження нирок з метаболічним синдромом.

У регіонах промислового виробництва з високим ступенем контамінації навколишнього середовища рівень захворюваності населення, як правило, вище, ніж у відносно «чистих» регіонах. Об'єктом наших досліджень було вибрано м Солігорськ, розташований в зоні масштабного видобутку і переробки калійних руд. У районах солевідвалів і шламосховищ калійних комбінатів утворилася зона хлоридно-натрієвої засолення, яка охоплює підземні води на глибину понад 100 м, що може впливати на забруднення джерел питного водопостачання та атмосферного повітря.

Для оцінки впливу забруднення окремих компонентів навколишнього середовища в регіоні промислового виробництва калійних добрив нами проведено аналіз ліпідних профілів сироватки крові як індикатора ранніх метаболічних порушень під впливом суміші хімічних речовин.

Мета роботи - виявлення метаболічних змін у лабораторних тварин при експозиції до відходів виробництва калійних добрив і споживанні питної води, отриманої з джерел, потенційно підданих впливу відходів виробництва, з використанням методу високоефективної рідинної хроматографії з мас-спектрометрической детекцией (ВЕРХ-МС).

Об'єктом дослідження була сироватка крові експериментальних тварин (морських свинок) дослідної та контрольної груп.

матеріали та методи

експериментальні дослідження проведені на 35 морських свинках (17 самок і 18 самців) масою тіла 305-347 г.

[Гієна і санітарія 3/2014

Досвідчена група (запал відходами промислового виробництва калійних добрив і питною водою з системи водопостачання м Солігорська), 20 особин (10 самок і 10 самців);

Контрольна група (запал фізіологічним розчином хлориду натрію для виключення результатів впливу стресового чинника, викликаного процедурою затравки), 15 особин (8 самців і 7 самок).

При проведенні експерименту щодня спостерігали за загальним станом тварин, споживанням корму і води.

Для моделювання хронічного інгаляційного впливу (12 тижнів) відходів виробництва калійних добрив керувалися МУ.№11-11-10-2002 «Вимоги до постановки токсиколого-алергологічних досліджень при гігієнічному нормуванні белоксодержащіх аерозолів в повітрі робочої зони», включаючи визначення затравочной дози. Зразки з солевідвалів розтирали в мармуровій ступці до однорідного пилоподібних стану, розчиняли в дистильованої воді до необхідної концентрації з урахуванням маси тіла експериментальних тварин (масу тіла контролювали щотижня для коригування дози). Розрахункові дози склали: на початок експерименту -2,028 мг / 0,1 см3, через 4 тижні - 2,85 мг / 0,1 см3, через 6 тижнів - 3,17 мг / 0,1 см3, через 8 тижнів і до кінця експерименту 3,8 мг / 0,1 см3.

Морську свинку без наркотизації фіксували в положенні на спині з піднятою головою, піпеточ-ним дозатором вводили по черзі в ніздрі (дрібно) дозу теплого розчину (протягом 2-3 хв) таким чином, щоб виключити чхання. Виникаючі «хлюпають» звуки підтверджували проникнення розчину в дихальні шляхи.

Досвідчена група тварин «вдихала» суміш щодня одноразово 5 днів на тиждень протягом 12 тижнів. Тварини контрольної групи «вдихали» фізіологічний розчин (0,9% NaCl).

Для відбору біологічного матеріалу тварин наркотизуйте (ефірний наркоз), після декапитации збирали кров. Сироватку одержували центрифугуванням при 3000 об / хв протягом 15 хв, зберігали при -20 С для подальших досліджень. У сироватці крові аналізували фосфоліпіди, оксістероіди, жирні кислоти.

Пробопідготовка. До сироватки крові додавали внутрішній стандарт - прогестерон до досягнення концентрації 10-5 М (10 мкл на 1 мл зразка). Потім для осадження білків, що містяться в зразку, і екстракції стероїдів додавали метанол до кінцевої концентрації 70% (на 1 мл зразка 2,33 мл метанолу) з подальшим центрифугуванням протягом 15 хв при 10 000 g. Білки, що містяться в зразку, утворювали при цьому щільний осад. Супернатант відокремлювали від осаду і пропускали через попередньо кондиціонованих колонку для твердофазної екстракції (ТФЕ-колонка), що містить 100 мг октадецілсілільного силикагеля. ТФЕ-колонку кондиціонованих послідовним пропусканням 2 мл метанолу, 2 мл води і 2 мл 70% метанолу. У першій стадії з колонкою зв'язується холестерин, зміст якого в плазмі крові та інших біологічних рідинах досить велике, а також ряд інших високогідрофобних ліпідів. Після зв'язування холестерину колонку додатково промивали 2 мл 70% метанолу. При високому вмісті холестерину в зразку або великому об'ємі зразка ви-

пользовали ТФЕ-колонку з великим вмістом сорбенту. Елюат об'єднували і випарювали. Випарювання здійснювали при 50 ° С в струмені інертного газу. Сухий залишок розчиняли в 500 мкл метанолу та центрифугували протягом 10 хв при 10 000 g. При цьому осідали полярні, нерозчинні в метанолі з'єднання. Супернанант відокремлювали від осаду і розбавляли водою до концентрації метанолу 10%. Отриманий розчин пропускали через попередньо кондиціонованих ТФЕ-колонку (пропускали 2 мл метанолу, 2 мл води і 2 мл 10% метанолу) і промивали 2 мл 10% метанолу. Зв'язалися з колонкою стероїди елюювали 3 мл 80% метанолу. Розчин випарювали і сухий залишок розчиняли в 100 мкл метанолу. Отриманий розчин аналізували з використанням ВЕРХ-МС.

ВЕРХ аналіз. Аналіз проводили на хроматографе Accela, оснащеному мас-спектрометричним детектором LCQ-Fleet. Поділ виконували на колонці Cosmosil 5C18-MS-II з геометричними параметрами 4,6 * 150 мм ( «Nacalai Tesque», Японія).

Програма поділу (розчинник А - вода, розчинник В - метанол, швидкість потоку 500 мкл / хв): протягом 5 хв 60% В, 12 хв - лінійний градієнт 60-95% В, 10 хв - 95% В, 8 хв - лінійний градієнт 95-100% В, 5 хв - 100% В, 5 хв - 60% В.

Для мас-спектрометричного аналізу використовували джерело хімічної іонізації при атмосферному тиску (APCI). Параметри джерела іонізації: температура випарника - 350 ° C, потік осушающего газу - 35 од., Потік допоміжного газу - 5 од., Температура капіляра - 275 ° С, напруга на капілярі - 18 В, напруга на іонному об'єктиві - 80 В. Використовували режим сканувань, залежних від даних (Data Dependent ™), із застосуванням іонної пастки в діапазоні сканування 50-1000 m / z.

Хроматограми, отримані за допомогою мас-спектрометричного детектора в режимі хімічної іонізації (повний іонний струм), переводили в текстовий формат з використанням програми Qual Browser з пакета Xcalibur ( "Thermo Sci", США). Отриману інформацію обробляли із застосуванням реалізованого в пакеті Statistica 10 методу головних компонент і інструментів для кластерного аналізу та побудови дендрограмм. Для розшифровки мас-спектрів та ідентифікації індивідуальних сполук використовували довідник.

Результати та обговорення

В якості вихідної методики для адаптації застосовували метод твердофазної екстракції стероїдів з сироватки і плазми крові, описаний в керівництві фірми «Macherey-Nagel" Solid phase extraction. Application guide, яке містить рекомендації щодо застосування колонок для твердофазної екстракції. Адаптована методика пробопідготовки з твердофазной екстракцією дозволила ефективно виділити фосфоліпіди, окси-стероїди і жирні кислоти з сироватки крові морських свинок.

Описана методика хроматографічного розділення дає можливість ефективно розділяти як стероїдні гормони, так і ліпіди, прісуствующімі в сироватці.

Згідно описаним методикам проведено аналіз зразків. На рис. 1 (див. 2-ю смугу обкладинки) для прикладу наведені накладені хроматограми, отримані при аналізі 3 зразків з дослідної групи (виділені

Мал. 4. Мас-спектри речовини з часом утримування 21,5 хв: а - хімічна іонізація при атмосферному тиску в негативному режимі; б - хімічна іонізація при атмосферному тиску в позитивному режимі.

червоним кольором) і 3 зразків з контрольної групи (виділені синім кольором). Аналогічна картина спостерігалася і в інших випадках.

Для обробки зазначених масивів даних застосували метод головних компонент (МГК) і кластерний аналіз, який дозволив виявити відмінності ліпідних профілів між контрольною та дослідною групами. МГК-графік 1-й і 2-й головних компонент, отриманих

при зниженні розмірності даних, представлений на рис. 2 (див. 2-ю смугу обкладинки). На графіку легко помітити, що точки об'єднуються в 2 групи, локалізовані відповідно в 1, 4 і 2, 3 квадрантах. При цьому точки, відповідні дослідних зразках, переважно потрапляють в 1 і 4 квадрант, точки, відповідні контрольних зразках, локалізовані в 2 і 3 квадрантах. Дендрограмма, отримана при кла-

[Гієна і санітарія 3/2014

Ідентифікація присутніх на хроматограмі піків

Час утримування, хв Основні піки в "+" - режимі Основні піки в "-" - режимі

19,15 393,7 446,8

448,7 493,5 623,4 524,4

19,35 87 227 271 335,5 353,3 371,2 389.1 448.2 493.3 405,4

21,50 316,1 390,0

430.3 448.4 779,1

23,8 319.4 391,6 429.5 783,2

24,35 414,8 448,8

31,73 313,3 330,9

33,9 231.5 245.5 263,3 281,1 295.1 305.2 371.3 521.0 663.1 279,4

речовина

фосфатидилхолін

арахінова кислота

Фосфатидними кислота 42: 4

Арахінова і докозате-траеновая кислоти

Докозапентаеновая

лінолева кислота

Дігідроксіхолестерін

стерном аналізі, наведена на рис. 3. Таким чином, статистичний аналіз хроматографических даних свідчить про відмінності метаболічних процесів, що протікають в організмах експериментальних тварин, що відносяться до контрольної і дослідної груп.

Для виявлення конкретних метаболічних змін були розшифровані мас-спектри і ідентифі-

царювати індивідуальні сполуки (див. таблицю). Недостатній для аналізу обсяг зразка не дав змоги виявити зміни профілю стероїдних гормонів в сироватці. Однак ліпіди з проміжною полярністю детектувати на хроматограмі.

Індивідуальні сполуки ідентифікували за допомогою аналізу мас-спектрів речовин, записаних при різних режимах іонізації. Так, мас-спектр речовини в двох режимах іонізації з часом утримування 21,5 хв представлений на рис. 4. Аналіз даного спектра показав, що речовина є ДІАЦ-sn-гліцерофосфатом з молекулярної масою 780 (R1 (311) \u003d 20: 0 жирна кислота (арахінова), R2 (331) \u003d 22: 4 жирна кислота (докозатетраеновая)).

Встановлено, що хроматографический пік з часом утримування 42,52 хв відповідає диги-дроксіхолестеріну, імовірно одному з попередників в біосинтезі жовчних кислот. Відмінності в змісті оксістероідов в сироватці крові свідчить про можливе порушення метаболізму жовчних кислот. Можна помітити, що на хроматограмах, представлених на рис. 1, в сироватці крові експериментальних тварин спостерігається підвищена в порівнянні з контрольною концентрація оксістеро-идов (піки з часом утримування 35-45 хв).

висновок. Використана в роботі методика дозволяє з високим ступенем ефективності виявляти ранні порушення ліпідного обміну при впливі поллютантов навколишнього середовища. Отримані результати свідчать про те, що інтраназаль-ве введення водних розчинів сольових відвалів експериментальним тваринам Cavia porcellus призводить до зміни метаболізму ліпідів і оксістероідов. Зокрема, спостерігається підвищений вміст попередників жовчних кислот (оксістероідов) у тварин може бути пов'язано з порушенням функції печінки і ферментів, які беруть участь в біосинтезі жовчних кислот. Таким чином, описаний підхід може бути використаний для виявлення порушень метаболізму ліпідів у жителів регіонів з техногенним забрудненням.

літер атура

1. Horning E.C., Horning M.G. Metabolic profiles: gas-phase methods for analysis of metabolites. Clin. Chem. 1971; 17 (8): 802-9.

2. Constantinou M.A., Tsantili-Kakoulidou A., Andreadou I., Iliodro-mitis E.K., Kremastinos D.T., Mikros E. Application of NMR-based metabonomics in the investigation of myocardial ischemia-reperfusion, ischemic preconditioning and antioxidant intervention in rabbits. Eur. J. Pharm. Sci. 2007; 30 (3-4): 303-14.

3. Lu W., Bennett B.D., Rabinowitz J.D. Analytical strategies for LC-MS-based targeted metabolomics. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2008; 871 (2): 236-42.

4. Novotny M.V, Soini H.A., Mechref Y. Biochemical individuality reflected in chromatographic, electrophoretic and mass-spectro-metric profiles. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2008; 866 (1-2): 26-47.

5. German J.B., Gillies L.A., Smilowitz J.T., Zivkovic A.M., Watkins S.M. Lipidomics and lipid profiling in metabolomics. Curr. Opin. Lipidol. 2007; 18 (1): 66-71.

6. Schwarz E., Liu A., Randall H., Haslip C., Keune F., Murray M. et al. Use of steroid profiling by UPLC-MS / MS as a second tier test in newborn screening for congenital adrenal hyperplasia: the Utah experience. Pediatr. Res. 2009 року; 66 (2): 230-5.

7. Rauh M. Steroid measurement with LC-MS / MS. Application

До ст. Чаховского і співавт.

Мал. 3. Дендрограмма, побудована на підставі кластерного аналізу та ілюструє кластеризацию зразків по групах.

До ст. Чаховского і співавт.

Мал. 1. Поєднані хроматограми зразків 1-3 з контрольної групи (виділено червоним кольором) і 15-17 з дослідної групи (виділено синім кольором).

Projection of the cases on the factor-plane (1 x 2) Cases with sum of cosine square\u003e \u003d 0.00

18/3 9 / з 21/1 ■ Про

1 позику "Ш про 28/1" 22/10 41/1 п

Factor 1: 65.71%

Мал. 2. Графік, отриманий шляхом обробки хроматограм за допомогою МГК. Контрольна група виділена синім кольором, досвідчена - червоним.

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) - це метод колонкової хроматографії, в якому рухомою фазою (ПФ) служить рідина, що рухається через хроматографічну колонку, заповнену нерухомою фазою (сорбентом). Колонки для ВЕРХ характеризуються високим гідравлічним тиском на вході в колонку, тому ВЕРХ іноді називають «рідинної хроматографією високого тиску».

Залежно від механізму розподілу речовин розрізняють наступні варіанти ВЕРХ: адсорбционную, розподільну, іонообмінну, ексклюзіонную, хіральнікатастрофу і ін.

У адсорбційної хроматографії поділ речовин відбувається за рахунок їх різної здатності адсорбуватися і десорбувати з поверхні адсорбенту з розвиненою поверхнею, наприклад, силікагелю.

У розподільній ВЕРХ поділ відбувається за рахунок відмінності коефіцієнтів розподілу поділюваних речовин між нерухомою (як правило, хімічно прищепленої до поверхні нерухомого носія) і рухомий фазами.

За полярності ПФ і НФ ВЕРХ поділяють на нормально-фазову і обернено-фазову.

Нормально-фазовим називають варіант хроматографії, в якому використовуються полярний сорбент (наприклад, силікагель або силікагель з прищепленими NH 2 - або CN-групами) і неполярний ПФ (наприклад, гексан з різними добавками). В обернено-фазовому варіанті хроматографії використовують неполярні хімічно модифіковані сорбенти (наприклад, неполярний алкільний радикал C 18) і полярні рухливі фази (наприклад, метанол, ацетонітрил).

У іонообмінної хроматографії молекули речовин суміші, диссоциированного в розчині на катіони і аніони, поділяються на своєму шляху через сорбент (катионит або аніоніт) за рахунок їх різної швидкості обміну з іонними групами сорбенту.

У ексклюзіонной (ситової, гель-проникаючої, гель-фільтраційної) хроматографії молекули речовин поділяються за розміром за рахунок їх різну здатність проникати в пори нерухомої фази. При цьому першими з колонки виходять найбільші молекули (з найбільшою молекулярною масою), здатні проникати в мінімальне число пір нерухомої фази, а останніми виходять речовини з малими розмірами молекул.

часто поділ протікає не по одному, а по кількох механізмів одночасно.

Метод ВЕРХ може застосовуватися для контролю якості будь-яких негазообразних аналізованих речовин. Для проведення аналізу використовують відповідні прилади - рідинні хроматографи.

До складу рідинного хроматографа зазвичай входять наступні основні вузли:

- вузол підготовки ПФ, включаючи ємність з рухомою фазою (або ємності з окремими розчинниками, які входять до складу рухомої фази) і систему дегазації ПФ;

- насосна система;

- змішувач рухомої фази (при необхідності);

- система введення проби (інжектор);

- хроматографічна колонка (може бути встановлена \u200b\u200bв термостаті);

- детектор;

- система збору та обробки даних.

насосна система

Насоси забезпечують подачу ПФ в колонку із заданою постійною швидкістю. Склад рухомий фази може бути постійним або змінним під час аналізу. У першому випадку процес називають ізократіческім, а в другому - градієнтним. Перед насосної системою іноді встановлюють фільтри з діаметром пор 0,45 мкм для фільтрації рухомої фази. Сучасна насосна система рідинного хроматографа складається з одного або декількох насосів, керованих комп'ютером. Це дозволяє змінювати склад ПФ за певною програмою при градієнтному елюювання. Змішання компонентів ПФ в змішувачі може відбуватися як при низькому тиску (до насосів), так і при високому тиску (після насосів). Змішувач можна використовувати для підготовки ПФ і при ізократіческом Елюювання, однак більш точне співвідношення компонентів досягається при попередньому змішуванні компонентів ПФ для ізократіческого процесу. Насоси для аналітичної ВЕРХ дозволяють підтримувати постійну швидкість подачі ПФ в колонку в інтервалі від 0,1 до 10 мл / хв при тиску на вході в колонку до 50 МПа. Доцільно, однак, щоб це значення не перевищувало 20 МПа. Пульсації тиску мінімізуються спеціальними демпферними системами, що входять в конструкцію насосів. Робочі деталі насосів виготовляються з корозійностійких матеріалів, що дозволяє використовувати в складі ПФ агресивні компоненти.

Згідно з даними огляду, надрукованого в Clinical Biochemist Reviews, застосування високоефективної рідинної хроматографії в поєднанні з тандемной мас-спектрометрією (ВЕРХ-МС / МС) в клінічних лабораторіях надзвичайно зросла протягом останніх 10-12 років. Автори відзначають, що специфічність аналізу ВЕРХ-МС / МС значно перевершує імунологічні методи і класичну високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ) при аналізі молекул з низькою молекулярною вагою і має значно більш високою продуктивністю, ніж газова хроматографія-мас-спектрометрії (ГХ-МС). Популярність цього методу при рутинних клінічних аналізах в даний час пояснюється унікальними можливостями методу.

Основними перевагами методу ВЕРХ-МС / МС є:
• Можливість точного кількісного аналізу малих молекул;
• Одночасний аналіз безлічі цільових сполук;
• Унікальна специфічність;
• Висока швидкість аналізу.

В останні роки багато уваги приділяється часу аналізу і, як наслідок, підвищенню виробник-ності лабораторії. Значне скорочення часу аналізу стало можливим завдяки застосуванню коротких аналітичних колонок для ВЕРХ / МС / МС, одночасно різко збільшився специфічність аналізу. Використання методу іонізації при атмосферному тиску (API), тандемного потрійного квадрупольного мас-спектрометра і вдосконаленою високоефективної рідинної хроматографії, а також відповідних методів підготовки зразків, привели ВЕРХ-МС / МС в перші ряди сучасних аналітичних методів для клінічних досліджень.

Основні області застосування ВЕРХ / МС / МС в клінічній медицині:
• Отримання повного профілю метаболізму стероїдів (steroids panels), пуринів і піримідинів та інших з'єднань,
  скринінг новонароджених на вроджені помилки метаболізму (виявлення декількох десятків захворювань за один аналіз);
• Терапевтичний моніторинг лікарських препаратів - імунодепресантів, перотівосудорожних, антиретровірусних, антикоагулянтів, і будь-яких інших - незалежно від наявності наборів виробника. Не потрібно купувати дорогі набори для кожної речовини - можна розробляти власні методики;
• Клінічна токсикологія - аналіз понад 500 наркотичних сполук та їх метаболітів за один аналіз, без підтверджуючого аналізу
  протеоміка і метаболоміка.

Крім того, ВЕРХ-МСМС використовується для скринінгу олігосахарідове в сечі, сульфатідов, дліноцепочечних жирних кислот, дліноцепочечних жовчних кислот, метилмалоновой кислоти, дослідження Порфирій, скринінгу пацієнтів з порушеннями пуринового і піримідинового метаболізму.

Приклади застосування рідинної хроматографії
в поєднанні з тандемной мас-спектрометрією в клінічних аналізах.

Скринінг новонароджених: Першим прикладом масового застосування ВЕРХ-МС / МС в клінічній діагностиці був скринінг вроджених помилок метаболізму у новонароджених. В даний час в розвинених країнах це є рутинним методом і охоплює більше 30 різних захворювань, включаючи ацедеміі, аміноацідопатіі, дефекти окислення жирних кислот. Слід особливо відзначити дослідження вроджених дефектів, які можуть призвести до серйозних проблем, якщо не вжити негайних заходів (наприклад, збільшені серце або печінку або набряк мозку). Перевагою використання ВЕРХ-МС / МС для скринінгу новонароджених є можливість одночасно аналізу всіх амінокислот і ацилкарнітину швидким, недорогим і високоспецифічний методом.

Терапевтичний моніторинг лікарських препаратів: Розробка і впровадження імунодепресанта сиролімусу (рапаміцин) для запобігання відторгнення органів після трансплантації була одним з основних стимулів впровадження ВЕРХ-МС / МС в клінічні лабораторії. Сучасний метод ВЕРХ-МС / МС дає можливість одночасного визначення такролімусу, сиролімусу, циклоспорину, еверолімусу і мікофенойной кислоти.

ВЕРХ-МС / МС застосовується також для аналізу цитотоксичних, антиретровірусних лікарських речовин, трициклічнихантидепресантів, антиконвульсантів і інших препаратів, що вимагають індивідуальної дозування.

Метод ВЕРХ-МСМС дозволяє розділити і кількісно визначити R- і S- енантіомери варфарину в діапазоні концентрацій 0.1-500 нг / мл.

Наркотичні і болезаспокійливі речовини: ВЕРХ-МС / МС широко застосовується для аналізу цих сполук завдяки простоті пробоподготовки і малому часу аналізу. В даний час метод використовується в клінічних лабораторіях для скринінгу на присутність широкого спектра наркотичних речовин. Унікальна специфічність і чутливість методу дає можливість одночасного аналізу більше 500 з'єднань різних класів в одній пробі з мінімальною пробопідготовкою. Так, у разі аналізу сечі, досить простого розведення проби в 50-100 разів. При аналізі волосся замість пучка в 100-200 волосся для достовірного виявлення фактів вживання наркотичних засобів досить одиничного волоса.

Ендокринологія та аналіз стероїдів: ВЕРХ-МС / МС широко застосовується в багатьох ендокринологічних лабораторіях для аналізу стероїдів - тестостерону, кортизолу, альдестерона, прогестерону, естріолу та багатьох інших.

Все більше лабораторій починають використовувати ВЕРХ-МС / МС для визначення рівня в крові вітаміну Д3 і Д2.

I. Визначення стероїдів (steroid profile).

Лабораторії при лікарнях і клініках в даний час мають можливість проводити за допомогою ВЕРХ / МС / МС одночасне визначення декількох стероїдів. При цьому немає необхідності у великому обсязі зразка, що особливо важливо при аналізах дитячих зразків.

Випадки, при яких доцільно проводити визначення кількох (профілювання) стероїдів:
• Вроджена гіперплазія надниркових залоз (Congenital adrenal hyperplasia, CAH) є вродженим дефектом біосинтезу стероїдів. Це спадкова група захворювань, викликана неправильною активністю ензимів кори надниркових залоз, що веде до зниження вироблення кортизолу. Для достовірної діагностики САН рекомендується визначати кортизол, андростендіон і 17-оксипрогестерон. ВЕРХ / МС / МС дозволяє проводити точне кількісне визначення всіх трьох стероїдів за один аналіз зі 100% вірогідністю.
• Рутинний скринінг новонароджених з використанням імуноаналізу відрізняється високим рівнем лоноположітельних і помилково негативні результати. Визначення за допомогою ВЕРХ / МС / МС не тільки кортизолу, а й альдостерону і 11-деоксикортизолу дозволяє відрізнити первинну недостатність кори надниркових залоз від вторинної.
• ВЕРХ / МС / МС дозволяє проводити визначення стероїдів при простатиті та синдромі хронічної тазової болі.
• ВЕРХ-МС / МС дозволяє визначити профіль стероїдів і ідентифікувати причини передчасного статевого дозрівання, пов'язаного з корою наднирників, у маленьких дітей. Було знайдено, що концентрації тестостерону, андростендіону, дегідроепіандростерона (DHEA) і його сульфату у цих дітей були трохи вище, ніж у старших дітей контрольної групи.
• Сироватка крові активних курців, пасивних курців і некурящих, аналізується на присутність 15 стероїдних гормонів і тиреоїдних гормонів для дослідження зв'язку між пацієнтами, схильними до дії диму, і концентраціями гормонів.
• ВЕРХ / МС / МС використовується при профілювання деяких жіночих стероїдних гормонів в сечі.
• За допомогою ВЕРХ / МС / МС була проведена оцінка концентрацій нейроактивних гормонів з метою запобігання діабетичної нейропатії.

II. Визначення тиреоїдних гормонів

Рутинні методи визначення тиреоїдних гормонів зазвичай засновані на радіоіммуноаналізе, який є дорогим і дозволяє визначати тільки Т3 і Т4, що може обмежувати можливості визначення і повного регулювання функцій щитовидної залози.

• В даний час при використанні ВЕРХ-МСМС проводиться одночасний аналіз в зразках сироватки крові п'яти тиреоїдних гормонів, включаючи тироксин (Т4), 3,3 ', 5-трііодотіронін (Т3), 3,3', 5'- (rT3), 3 , 3'дііодотіронін (3,3 '-T2) і 3,5-дііодотіронін (3,5-T2) в діапазоні концентрацій 1 -500 нг / мл.
• Метод ВЕРХ / МС / МС застосовується також для аналізу складу гормонів пацієнтів, які пройшли тиреоїдектомію. Визначаються рівні концентрацій тироксину (Т4), трііодотіроніна (Т3), вільного Т4 і тиреоїд стимулюючого гормону (ТSH) після операції. Встановлено, що ВЕРХ / МС / МС є прекрасним способом встановлення взаємозв'язку між ТSH і концентраціями тиреоїдних гормонів.
• Метод ВЕРХ / МС / МС був застосований для визначення тироксину (Т4) в слині і сироватці крові людини. Метод відрізняється високою відтворюваністю, точністю і межею виявлення 25 пкг / мл. Проведені дослідження показали, що існує діагностична залежність в концентраціях Т4 в слині між еутиреоїдного випробуваними і пацієнтами з хворобою Грейвса.

Метод ВЕРХ / МС / МС в даний час володіє чутливістю, специфічністю і точністю, необхідними для надійного визначення всіх стероїдів в біологічних рідинах і таким чином підвищує діагностичні можливості, особливо в разі визначення наборів стероїдів.

III. Визначення 25-оксівітаміна Д методом ВЕРХ / МС / МС

25-окси вітамін Д (25ОД) є основною циркулюючої формою вітаміну Д і попередником його активної форми. (1,25-діоксівітамін Д). Зважаючи на тривалий період його напіввиведення визначення 25ОД важливо для визначення статусу вітаміну Д в організмі пацієнта. Вітамін Д існує в двох формах: вітамін Д3 (холекальциферол) і вітамін Д2 (ергокальциферол). Обидві форми метаболизируют в соответствуюших 25ОД форми. Дуже велике значення для діагностики має наявність аналітичних методів, які можуть визначати з високою точністю обидві форми вітаміну і дозволяють проводити моніторинг пацієнтів з порушеннями вмісту вітаміну Д. Застосовувані до сих пір методи не дозволяли проводити роздільне визначення вітаміну Д2 і Д3. Крім того, при високих концентраціях вітаміну Д2 знижується визначається кількість Д3. Іншим недоліком є \u200b\u200bзастосування радіоактивних ізотопів. Застосування методу ВЕРХ / МС / МС дозволило не тільки уникнути застосування радіоактивних ізотопів, а й проводити роздільне визначення обох активних форм вітаміну.

Метод застосуємо для наступних пацієнтів:
1. При підозрі на знижений вміст вітаміну Д в організмі;
2. При підозрі на незрозуміле токсичний вплив;
3. При обстеженні пацієнтів, що проходили курс лікування з приводу пониженого вмісту вітаміну Д;
4. Використання ВЕРХ / МС / МС дозволило проводити роздільне визначення обох форм при моніторингу пацієнтів.

IV. Визначення імунодепресантів методом ВЕРХ / МС / МС

Після трансплантації органів необхідно приймати імунодепресанти протягом усього життя, щоб уникнути реакції відторгнення. Володіючи дуже вузький терапевтичний діапазон і високу токсичність, імунодепресанти вимагають індивідуальної дозування для досягнення максимального ефекту. Тому життєво важливим є моніторинг основних імунодепресантів: циклоспорину А, такролімусу, сиролімусу і еверолімусу для регулювання дози ліків для кожного індивідуального пацієнта в залежності від концентрації препарату в крові.

Іммуноаналіз все ще використовується для моніторингу перерахованих лікарських препаратів, проте ці методи дорогі і їх специфічність, точність і відтворюваність обмежені. Відомі випадки загибелі пацієнтів від неправильного дозування імунодепресантів, заснованих на результатах, отриманих за допомогою імунологічних методів. В даний час імуноаналізу замінюються в клінічних лабораторіях на ВЕРХ / МС / МС. Так, в клініці університету Мюнхена щодня проводиться аналіз близько 70 зразків на вміст сиролімусу і циклоспорину А з використанням ВЕРХ / МС / МС системи. Вся підготовка зразків і керування приладом здійснюється одним співробітником. Лабораторія перемикається також на аналіз такролімусу цим методом.

• Описано застосування ВЕРХ / МС / МС для рутинного одночасного визначення такролімусу, сиролімусу, аскоміціна, деметіксісіролімуса, циклоспорину А і циклоспорину G в крові. Діапазон можна визначити концентрацію 1.0 - 80.0 нг / мл. Для циклоспорину 25 - 2000 нг / мл. Протягом року в лабораторії було проаналізовано понад 50,000 зразків.
• Оскільки було встановлено, що одночасне застосування такролімусу і сиролімусу дає позитивний терапевтичний ефект, був розроблений простий і ефективний ВЕРХ / МС / МС метод роздільного їх визначення в крові для клінічних аналізів. Аналіз одного зразка займає 2.5 хвилини з точністю від 2.46% - 7.04% для такролімусу і 5.22% - 8.30% для сиролімусу для всієї аналітичної кривої. Нижня межа визначення такролімусу 0.52 нг / мл, сиролімусу - 0.47 нг / мл.

V. Визначення гомоцистеїну методом ВЕРХ / МС / МС

Гомоцистеїн представляє інтерес при серцево-судинних захворюваннях (тромбоемболії, хворобах серця, атеросклерозі) та інших клінічних станів (депресії, хвороби Альцхаймера, остеопорозі, ускладненнях при вагітності та ін.). Існуючі методи аналізу гомоцистеїну, включаючи імунноаналіз, є дорогими. Розроблено швидкий ВЕРХ / МС / МС метод аналізу гомоцистеїну для рутинного клінічного застосування при аналізі великої кількості зразків. Іонізація проводилася методом електрораспиленія. Метод є відтвореним, високоспецифічний і точним. Перевагами методу є також низька вартість реагентів і простота пробоподготовки. В добу можливо проводити аналіз 500 і більше зразків.

висновок

Слід зазначити, що навіть при тому, що в даний час використовуються значно вдосконалені методи імуноаналізу, в силу технічних принципових обмежень, даний метод ніколи не буде мати порівнянної з ВЕРХ-МСМС точністю і специфічністю до цільового речовини, особливо в присутності метаболітів. Це не тільки призводить до низької точності методу ІФА і високому відсотку хибно-позитивних та хибно-негативних результатів, але і не дозволяє порівнювати результати, отримані в різних клінічних відділеннях при використанні методу ІФА. Застосування ВЕРХ-МС / МС усуває цей недолік, дозволяє проводити високоспецифічний, точний і швидкий аналіз великої кількості зразків з високою вірогідністю в присутності метаболітів і відсутності перешкод від супутніх і ендогенних речовин, що знаходяться в плазмі і крові пацієнтів.

Незважаючи на гадану дорожнечу приладового комплексу, як показує світова практика, при правильній експлуатації, даний комплекс окупається за 1-2 роки. Це відбувається, перш за все, завдяки низькій собівартості одного аналізу за рахунок одночасного аналізу десятків і сотень сполук і відсутності необхідності придбання дорогих діагностичних наборів. Крім цього, у лабораторії з'являється можливість самостійно розробляти будь-які необхідні методики аналізу і не залежати від виробника наборів.

Вибір правильної конфігурації приладового комплексу

існує велика кількість різних методів мас-спектрометрії і типів мас-спектрометрів, призначених для вирішення найрізноманітніших завдань - від структурної ідентифікації складних білкових макромолекул масою в сотні тисяч Дальтон до рутинного високопродуктивного кількісного аналізу малих молекул.

Для успішного вирішення поставленого завдання одним з основних умов є вибір правильного типу обладнання. Не існує універсального приладу, що дозволяє вирішувати весь спектр аналітичних задач. Так, прилад, призначений для розв'язання задачі ідентифікації мікроорганізмів, не здатний проводити кількісний аналіз малих молекул. І навпаки. Справа в тому, що, незважаючи на загальну назву, це абсолютно різні прилади, що працюють на різних фізичних принципах. У першому випадку це часопролітної мас-спектрометр з лазерним джерелом іонізації - MALDI-TOF, а в другому - потрійний квадруполь з іонізацією електроспреем - ВЕРХ-МСМС.

Другим за значимістю параметром є вибір правильної конфігурації системи. Існує кілька основних виробників мас-спектрометричного устаткування. У приладів кожного виробника є не тільки свої сильні, але і слабкі сторони, Про які вони зазвичай воліють замовчувати. Кожен виробник випускає свою лінійку приладів. Вартість одного аналітичного комплексу знаходиться в інтервалі вартістю від 100,000 до 1,000,000 і більше доларів. Вибір оптимального виробника і правильної конфігурації обладнання дозволить не тільки заощадити значні фінансові ресурси, а й більш ефективно вирішувати поставлену задачу. На жаль, існує багато прикладів, коли оснащення лабораторії проводилося без урахування цих чинників. Результат - обладнання, що простоює, марно витрачені гроші.

Третім фактором, що визначає успішну роботу лабораторії, є персонал. Для роботи на мас-спектрометрах потрібно висококваліфікований персонал. На жаль, ні в одному вузі Росії немає курсу сучасної практичної мас-спектрометрії, особливо стосовно до клінічних додатків, і завдання навчання персоналу кожної лабораторії доводиться вирішувати своїми силами. Природно, 2-3 днів ознайомчого тренінгу, проведеного виробником після запуску обладнання, абсолютно недостатньо для розуміння основ методу і придбання навичок роботи на приладі.

Четвертим фактором є відсутність готових методик аналізу. У кожній лабораторії є свої пріоритетні завдання, для вирішення яких необхідно розробляти свої методики. Робити це може людина, що володіє досвідом роботи на приладі не менше 2-3 років. Фірми-виробники іноді постачають одну-дві загальні методики рекомендаційного характеру, але не адаптують їх під конкретні завдання лабораторії.

В ТОВ «БіоФармЕкcперт» працюють фахівці з багаторічним стажем роботи на різних типах мас-спектрометрів, а також розробці методик і постановці високопродуктивних аналізів. Тому ми надаємо наступні послуги:

1. Вибір оптимальної конфігурації приладу під конкретні завдання клієнта.
2. Закупівля, постачання і запуск обладнання провідних виробників тандемних мас-спектрометров.Поетапное навчання персоналу протягом року з моменту запуску обладнання.
3. Набір готових методик і баз даних для вирішення основних клінічних завдань.
4. Розробка методик аналізу і вирішення конкретних завдань клієнта в його лабораторії із залученням його персоналу.
5. Методична підтримка на всіх стадіях роботи.